眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织核因子-κBp65、血管细胞黏附分子-1表达细胞黏附分子影响

宓 丹 马贤德 王 建

(辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110034)

干预脑缺血后炎性反应的某些环节，减少神经元凋亡，已成为脑梗死治疗的重要环节〔1〕。核因子(NF)-κB是一种重要的转录因子，激活后的NF-κB可高效诱导多种细胞因子、黏附分子和趋化因子表达，同时对参与炎症反应放大与延续(即级联瀑布效应)的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用〔2〕。血管细胞黏附分子(VCAM)-1属于黏附因子，与脑缺血再灌注损伤的炎症机制密切相关。本实验通过探讨眼针对NF-κB p65，VCAM-1表达的影响阐述眼针对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 健康SPF级SD大鼠40只，雌雄不拘，体重(280±20) g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，许可号：SCXK(沪)2008-0016。随机数字法将大鼠分为对照组、假手术组、模型组、眼针组4组，每组10只。

1.2模型制备与评价 参照文献〔3〕，模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。模型成功标准：大鼠于缺血2 h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照Longa 5分制评分标准〔4〕：0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1 cm。正常组未做处理。

1.3眼针取穴及刺法 眼针组：用31号13 mm毫针，于大鼠眶周2 mm处针刺，定位参照人体取穴方法〔5〕，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。手法：平刺，进针3 mm。留针20 min，留针期间捻转行针3次，每次1 min。治疗时机：眼针组于脑缺血再灌注即刻针刺1次，动物存活期每12 h进针1次，最后1次进针30 min后取材。

1.4主要试剂 NF-κB p65、 VCAM-1一抗(武汉博士德)，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德)，抗原修复液(北京博奥森)，其余试剂由辽宁中医药大学实验室提供。

1.5标本采集与处理 动物完成观察时间后，以10%水合氯醛按标准量麻醉大鼠，开胸暴露心脏，将灌注针头从心尖部位插入心脏，剪开右心耳，依次迅速灌注20 ℃的0.9%生理盐水200 ml、4 ℃的4%多聚甲醛200 ml，灌毕迅速取脑，在视交叉平面前后2 mm处将脑冠状切面切开，留取中间部分置于4 ℃的4%多聚甲醛固定液中过夜。常规上行脱水、透明后用石蜡包埋，连续切片，切片厚5 μm，每隔10张取一张，使每一张切片上都有海马。

1.6指标检测 免疫组化(SABC法)检测。切片脱蜡至水，抗原修复液修复，滴加封闭液，滴加1∶100兔抗鼠抗体，过夜，加SABC。DAB显色、复染、脱水、透明，封片。采用全自动彩色图像处理系统进行图像分析，每只大鼠随机选取3张非连续的脑片，在×400镜下，计数VCAM-1，NF-κB p65阳性细胞数。观察免疫组织化学检测结果阳性反应为细胞质或细胞核的棕黄色深染。

2 结 果

2.1眼针对脑缺血再灌注损伤24 h后大鼠神经缺损评分影响 模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，假手术组大鼠无神经功能障碍表现。模型组造模后即刻与眼针组造模后即刻神经功能缺损评分无差异(2.1±0.56,2.2±0.78，P>0.05)，模型组24 h后神经功能障碍加重，眼针组24 h后与模型组比神经功能缺损评分有差异(2.0±0.66,2.2±0.78，P<0.05)。

2.2眼针对脑缺血再灌注损伤24 h后大鼠海马组织NF-κB p65及VCAM-1蛋白表达的影响 表1可见，缺血再灌注模型组中，海马组织VCAM-1值同假手术组比较明显增加(P<0.01)，表明脑缺血再灌可使缺血侧海马的VCAM-1增强。眼针组与模型组比较，则明显减少缺血侧海马VCAM-1表达(P<0.05)，表明眼针可显著抑制VCAM-1的表达。缺血再灌注模型组中，NF-κB p65值同假手术组比较明显增加(P<0.01)，表明脑缺血再灌可使海马组织的NF-κB p65表达上调。眼针组与模型组比较，则明显抑制了NF-κB p65的表达水平(P<0.05)，也表明眼针可显著下调NF-κB p65在海马组织的表达水平。见图1。

表1 眼针对NF-κB p65及VCAM-1蛋白表达的影响

NF-κB p65对照组

NF-κB p65 模型组

NF-κB p65眼针组手术

NF-κB p65假手术

VCAM-1对照组

VCAM-1假手术组

VCAM-1 模型组

VCAM-1眼针组

3 讨 论

脑缺血再灌注后脑组织促发的炎症反应是造成脑缺血再灌注损伤的主要原因之一，缺血性脑损伤的炎症反应是由多种细胞因子介导的一种连锁过程。打断这种炎症的连锁反应，是目前研究治疗脑缺血再灌注损伤的重点。 NF-κB最初是从B细胞核提取物中发现的一种能与免疫κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子〔6〕，是一种重要的转录因子，广泛存在于真核细胞中，可被许多因素如细胞因子、氧化剂等激活，进而参与多种基因的表达调控。NF-κB属于Rel蛋白家族，有5种亚单位:RelA(p65)、RelB、c-Rel、pl05/P50(NF-κBl)和P100/p52(NF-κB2)。p65组成的同源或异源二聚体是NF-κB主要活性形式，在激活靶基因转录过程中起着重要作用〔7〕。近年发现，转录因子NF-κB与炎症反应密切相关，活化的NF-κB可直接调控参与脑缺血再灌后炎性损伤的多种介质基因的表达，例如ICAM-1、E选择素、VCAM-1、白细胞介素(IL)-1、IL-8、IL-6、TNF-α、COX-2〔8〕。王拥军等〔9〕应用大鼠MACO模型，运用免疫组化方法检测NF-κB的免疫活性，发现缺血2 h后就可见到p65的表达，在12 h达高峰，从24 h开始逐渐衰减。在此过程中，p65免疫活性细胞遍及纹状体和大脑皮质缺血区，而且p65普遍存在于胞核和胞质，说明脑缺血后NF-κB被激活，活化的NF-κB由细胞质向细胞核移位。Liu等〔10〕研究表明，大鼠永久性大脑中动脉阻塞后缺血皮质区细胞胞质或胞核内NF-κB表达增强，使用Oxymatrine后NF-κB表达降低，脑梗死病灶减小。Zhang等〔11〕发现，大鼠脑缺血的同时经脑室注射前列腺素，能够抑制NF-κB p65亚单位的表达，起到保护神经元的作用。以上研究均提示，通过抑制NF-κB p65表达来减少细胞凋亡，可能是治疗脑缺血再灌注损伤的机制之一。

脑缺血再灌注损伤时，白细胞过度的黏附滚动和牢固黏附进而向血管外游走，释放蛋白酶及毒性氧化物，促进炎症反应，导致脑组织缺血再灌注损伤，VCAM-1作为介导白细胞与血管内皮细胞黏附的重要因子在这一过程中起重要作用。正常情况下VCAM-1低水平存在于血管内皮细胞膜上，受致炎因子刺激时表达增加。VCAM-1的表达能使白细胞释放更多炎性介质和细胞因子，后者又增加VCAM-1表达，两者互为正反馈作用，从而加重脑缺血再灌注后的炎症反应，形成恶性循环〔12〕。张莉莉等〔13〕发现应用抗VCAM-1单克隆抗体后，缺血区微动脉内白细胞附壁密度指数有显著性降低，局部脑组织中白细胞聚集和神经元损伤也有明显减轻，提示抗VCAM-1单克隆抗体可起到一定的缺血性脑保护作用。

本实验结果说明缺血、缺氧可以促进NF-κB p65，VCAM-1的表达，而眼针可能通过下调NF-κBp 65水平表达，抑制脑梗死后脑微血管内皮细胞表面VCAM-1的表达，从而减少中性粒细胞在缺血区脑组织募集浸润，抑制炎症介质释放，阻断了炎症反应恶性循环，保护缺血脑组织，其具体的作用机制仍需深入探讨。

4 参考文献

1Monje ML,Toda H,Palmer TD. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis〔J〕. Science,2003;302(5651):1760-5.

2Goebeler M,Gillitzer R,Kilian K,etal. Multiple signaling pathways regulate NF-KappaB dependent transcription of the monocyte chemoattractant protein-1 gene in primary endothelial cell〔J〕.Blood,2001;97(1)：46-55.

3马贤德，孙宏伟.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中华中医药学刊，2009；27(6)：1200-1.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1)：84-91.

5彭静山.眼针疗法〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社，1990：11.

6Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factor interact with the immunoglobulin enhancer sequences〔J〕.Cell,1986;46(5)：705.

7Berti R,Williams AJ,Moffett JR,etal. Quantitative Real-Time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain iniury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2002;22：1068-79.

8Lentsch AB,Ward PA. The NF-kappaB/1kappa B system in acute in flammation〔J〕.Arch Immunol Ther Exp,2000;48(2)：59-63.

9王拥军，何 芳，李小玲.白藜芦醇对实验性脑缺血的保护作用〔J〕. 中华医学杂志，2003；83:534-6.

10Liu Y,Zhang XJ,Yang CH,etal.Oxymatrine protects rat brains against permanent focal ischemia and down regulates NF-kB expression〔J〕. Brain Res,2009;1268：174-80.

11Zhang HL,Gu ZL,Savitz SI,etal.Neuroprotective effects of prostaglandin A in rat models of permanent focal cerebral ischemia are associated with nuclear factor-kappaB inhibition and pemxisome proliferator activated receptor-ganmm upregulation〔J〕.J Neurosci Res,2008;86(5)：1132-41.

12张丽慧，魏尔清.ICAM-1，VCAM-1在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控〔J〕.中国药理学通报，2005；21(11)：1281.

13张莉莉，王景周，周华东，等.大鼠脑缺血再灌注后VCAM-1的表达与粘附性变化〔J〕.中国临床神经科学，2002；10(4)：329-31.