乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化能力的影响

蔡华珍 李冬雪 肖和平

(滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000)

传统经验与近来的研究认为，乌鸡黑色素具有滋补、抗衰老、抗疲劳、调理机体平衡等作用，是乌鸡滋补健身、延缓衰老的物质基础〔1，2〕。在乌鸡黑色素性质的研究上实验已证明：乌鸡黑色素具有抗氧化作用〔2～4〕；通过对果蝇喂饲研究发现，乌鸡黑色素能够显著延长果蝇的平均寿命〔5〕，然而在对小鼠体内的抗氧化指标的研究上却未发现与对照组有显著差异〔6〕。本研究旨在探讨乌鸡黑色素对衰老模型小鼠的肝脏、大脑及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及相关脏器的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 昆明种小鼠，雌雄各半，平均体重24～30 g，购自安徽科技学院动物实验中心。

1.2主要药品与试剂 乌鸡黑色素：从泰和乌鸡(购自江西省泰和县生物谷食品科技工业园)中提取；D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司)；考马斯亮蓝G250(中国医药上海化学试剂公司)；牛血清清蛋白(国药集团化学试剂有限公司)。无水乙醇、冰乙酸、石油醚、乙醚、氯化钠等均为分析纯； SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1乌鸡黑色素的提取工艺〔7〕全净膛乌鸡→剔骨取肉→绞碎→加热(肉水比1∶1，100℃ 5 min)→木瓜蛋白酶酶解→风味酶酶解→灭酶→过滤→离心→收集沉淀物→醚洗、水洗至pH中性→沉淀物→冻干→黑色素。

1.3.2小鼠的分组及造模〔8，9〕昆明种小鼠80只，3月龄左右。普通饲料适应喂养6 d后，将小鼠随机分为8组，其中，4组用于生理生化指标的测量，另4组用于脏器指数的测定，两者分组相同，即每组10只，正常对照组、模型组、黑色素低剂量组，黑色素高剂量组。各组连续灌胃、注射43 d。模型组每日颈背部皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，并灌胃与黑色素组等体积的0.1%琼脂液；正常对照组每日颈背部皮下注射等体积灭菌生理盐水，灌胃与黑色素组等体积的0.1%琼脂液；黑色素组每日颈背部皮下注D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，黑色素低、高剂量组分别按900、1 800 mg·kg-1·d-1剂量灌胃黑色素，黑色素用0.1%琼脂液分散。每周记录1次体重，随时观察小鼠的生长情况。小鼠行动迟缓、毛色松散无光泽、自发性活动减少、形体瘦弱、呈现明显的衰老特征时，证明衰老模型建立成功。于末次给药1 d后，摘除眼球取血分离血清，4℃低温保存备用；颈椎脱臼法处死动物，快速分离肝脏和脑组织，于-20℃冻存备用。进行各项指标测定。

1.3.3MDA含量、SOD、GSH-Px活力的测定 严格按照试剂盒说明书测定肝、脑组织以及血清中的MDA含量，SOD、GSH-Px活力。

1.3.4组织蛋白含量测定 考马斯亮蓝法〔10〕。

1.3.5小鼠器官指数的测定〔11〕颈椎脱臼法处死动物，快速取出脑、胸腺、脾、肝、肾，剔除表面脂肪，用4℃生理盐水冲净表面残血，用滤纸吸收水分，精确称取其重量，按照以下公式计算：器官指数=器官重(mg)/体重(g) 。

2 结 果

2.1乌鸡黑色素对D-半乳糖衰老模型小鼠体貌特征及体重的影响 实验开始2 w后，模型组小鼠毛发出现凌乱无光现象，注射处开始出现炎症反应，其他组无此现象。4 w后模型组小鼠行动较为迟缓，毛色松散无光泽，炎症加剧，但黑色素组小鼠生长良好，毛发光亮浓密，活泼好动，至第42天黑色素组模型小鼠一直生长良好，而模型组体形消瘦，脊椎隆起，行动迟缓。用药后14 d内各组小鼠体重无明显差异；到第21天，模型组体重比黑色素高剂量组的明显降低(P<0.05)，但与其他各组间无显著差异；第35天时，模型组体重均低于其他各组(P<0.05)；到了第42天，模型对照组与其他各组之间差异均达极显著水平(P<0.01)，并且正常对照组的体重亦低于黑色素高剂量组(P<0.05)。这说明乌鸡黑色素能够抵御D-半乳糖的致衰老干扰，促进衰老模型小鼠的生长。见表1。

表1 乌鸡黑色素对D-半乳糖衰老模型小鼠体重的影响

2.2乌鸡黑色素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝脏、大脑、血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影响 正常对照组、黑色素组小鼠肝脏、大脑、血清中的SOD、GSH-Px活力极显著高于模型组(P<0.01)，与黑色素低剂量组比较，高剂量黑色素对D-半乳糖致衰小鼠大脑中GSH-Px活力影响更显著(P<0.01)，但黑色素各剂量组之间肝脏、大脑、血清中的SOD差异均不显著。因此，乌鸡黑色素能显著提高D-半乳糖致衰小鼠肝脏、大脑、血清中的SOD、GSH-Px活力。见表2，表3。

在对MDA含量的影响方面，衰老模型组小鼠肝脏、大脑和血清中MDA含量均极显著高于其他各组(P<0.01)；黑色素高、低剂量组间肝脏和血清中MDA含量差别不大，但是大脑的MDA含量，却是高剂量组极低于低剂量组(P<0.01)，这与黑色素高剂量组大脑中GSH-Px高活力相对应。表明乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠细胞脂质过氧化损伤有保护作用，尤其对大脑保护作用更显著，其保护作用与黑色素成正比。见表4。

表2 乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠肝脏、大脑和血清中SOD的影响

2.3乌鸡黑色素对D-半乳糖衰老模型小鼠器官指数的影响 黑色素组各器官指数均极显著高于模型组(P<0.01)，略高于正常对照组(P>0.05)。黑色素高剂量组各器官指数亦略高于黑色素低剂量组，但差异不显著，说明黑色素可显著提高D-半乳糖致衰小鼠的器官指数，但黑色素剂量影响差别不大。见表5。

表3 乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠肝脏、大脑和血清中GSH-Px的影响

表4 乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠肝脏、大脑和血清中MDA的影响

表5 乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠脑指数和脏器指数的影响

3 讨 论

随着年龄的增长，机体内自由基防御系统如SOD、GSH-Px等功能下降，这种平衡逐渐被破坏，造成自由基过剩。过量自由基可通过过氧化作用攻击细胞膜及核酸、蛋白质和酶类等生物大分子，造成生物膜的结构损伤和功能障碍，DNA基因突变或复制异常及生物酶活力下降，最终导致细胞功能严重受损以至衰老、死亡〔12〕。

MDA是体内自由基引发脂质过氧化产物之一，其含量可间接判断体内自由基对机体的损伤程度以及衰老的程度；SOD能及时清除机体生成的过量自由基，从而保护细胞免受氧自由基的攻击，因而SOD活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力；GSH-PX是机体广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异性地催化还原型GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能的完整作用〔12，13〕。

因此，通过测定自由基清除系统的SOD、GSH-Px等活力，以及MDA含量，可以观察肌体的氧化损伤情况。

D-半乳糖所致亚急性衰老模型是与自然衰老所出现的生化改变相近的实验动物模型〔14〕。D-半乳糖可导致糖代谢紊乱，蛋白质、脂肪代谢异常，使体细胞发生退行性变化，产生多项生化指标变化，如SOD等活性降低和MDA水平升高等〔13，15〕。

本实验结果提示乌鸡黑色素能提高衰老模型小鼠机体清除自由基的能力，降低机体内脂质过氧化程度，乌鸡黑色素具有延缓衰老之功能。

但是，这一结果与胡泗才等〔3，16，17〕研究乌鸡黑色素对老龄小鼠红细胞及肝细胞SOD活性没有明显影响；对老龄小鼠的血浆过氧化脂质含量也没有明显影响结果不同。对此，周伟伟等〔18〕分析认为，乌鸡黑色素性质较稳定，难溶于水等溶剂，胡泗才等试验效果不理想的原因是未能找到溶解乌鸡黑色素的溶剂，从而造成乌鸡黑色素在机体内吸收效果不够理想。但本研究认为，胡泗才等的结果可能是黑色素的饲喂方式所致，由于他们均采用将乌鸡黑色素加入小鼠饲料中喂养，而小鼠的习性会啃咬部分食物用来磨牙，从而使得乌鸡黑色素摄入量不够。本试验采用灌胃法则避免了黑色素的损失，乌鸡黑色素的难溶性并未影响试验效果，相反小鼠吸收效果良好，这也可能与小鼠的胃肠液功能等有关，具体的吸收机制目前尚不清楚。

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