开口箭不同提取部位对异丙肾上腺素致小鼠心肌肥厚的保护作用

贺海波 白彩虹 邹 坤 袁 琴 龚学谦 陈置丰 颜为红 次旦多吉

(三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002)

开口箭为百合科植物开口箭Tupistra chinensis Bak.的干燥根茎。别名开喉箭、万年青、岩七、竹根七、虎尾七、马尾七等，主产于湖北三峡库区及神龙架林区。该药使用方便，疗效显著，已有数百年的应用历史，在土家民间享有极高声誉，亦为神农架四大名药之一〔1，2〕。其性寒，味甘、微苦，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛之功。主要用于咽喉肿痛，白喉，风湿痹痛，跌打损伤，胃痛，痈肿疮毒，毒蛇、狂犬咬伤，月经不调等症的治疗〔3〕。现代药化和药理学研究发现其主要成分为皂苷类(如呋甾、螺甾)，多是呋甾，其次是螺甾，具有很强的生理和药理活性〔4～6〕。此外还含有多糖、黄酮、挥发油及微量元素等成分，对中枢神经系统、消化系统、免疫系统和肿瘤防治及抗炎均具有较好的作用〔7～12〕。近年来，随着乐开礼等〔13～15〕证实其强心作用的存在和笔者在研究中大量强心苷类成分的发现〔5，6〕，其对心血管系统影响日益引起了笔者的关注。在前期研究中，笔者发现开口箭不同提取部位对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血损伤具有较好的保护作用，本研究拟在此基础上进一步探讨其不同提取部位对ISO致小鼠心肌肥厚的保护作用，为其将来临床应用于心血疾病防治提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1动物 KM小鼠(清洁级)105只，20～25 g，雌雄各半，由三峡大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2011-0012。动物按性别分笼，饲养于空调室内，室温(22±2)℃，湿度(60±5)%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食，给药前适应性饲养1 w。

1.2药物与试剂 开口箭采集于神农架林区木鱼镇，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室汪鋆植教授鉴定为百合科铃兰族开口箭属植物开口箭。盐酸异丙肾上腺素(Isoprenaline，ISO)注射液，上海禾丰制药有限公司生产，批号110201。卡托普利，中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号0810031；用0.5 %羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制开口箭不同提取部位和卡托普利的灌胃溶液。羟脯氨酸(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、试剂盒购于南京建成生物工程研究所。其他试剂均为市售分析纯。

1.3仪器 JA2003型电子分析天平，上海天平仪器厂；JY10001电子称重器，上海精密科学仪器有限公司；PK-600S 型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；SHZ-D(A)型循环水真空泵，上海精科实业有限公司；RE-52-AA 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KDM 型调温加热套，上海亚荣生化仪器厂；Labconco低温冷冻干燥仪，美国Labconco公司；UV-2000型紫外-可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；自动平衡离心机(LDZ5-2型)，北京医用离心机厂；ULTRACUT-R型超薄切片机，德国Leica公司；Q500型图像分析仪，德国Leica公司；H-7500型透射式电子显微镜，德国Leica公司。

1.4方法

1.4.1开口箭不同提取部位的制备 取开口箭1.0 kg粉碎，加70%乙醇10倍量回流提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液抽滤除杂，回收乙醇至无醇味后加水混悬，水液分别依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚萃取部位真空干燥后，得石油醚部位20.0 g；提取液然后用乙酸乙酯萃取至无色，合并乙酸乙酯层，挥干，得乙酸乙酯部位20.0 g；水层继续用水饱和正丁醇萃取至无色，合并正丁醇层，挥干，得正丁醇部位300.0 g；剩余也挥干，得水溶性部位50.0 g，4℃保存备用，用前以0.5% CMC-Na配制。

1.4.2实验分组及心肌肥厚模型的制作 将KM小鼠按完全随机设计分组法分为正常组、模型组、开口箭石油醚部位组、开口箭乙酸乙酯部位组、开口箭正丁醇部位组、开口箭水提部位组和阳性药卡托普利组，每组15只。开口箭不同提取部位组分别灌胃给予15.6、15.6、234.0和39.0 mg/kg的开口箭提取部位(此剂量依照《湖北省中药材质量标准》中开口箭成人的临床用药量2倍换算成小鼠药量，然后结合开口箭不同提取部位中的得率来确定)，阳性对照组给予卡托普利30.0 mg/kg(按成人的临床用药量2倍换算成小鼠药量)。按Maulik等〔16〕的方法制作心肌肥厚模型。具体方法简述如下：模型组、开口箭不同提取部位组和卡托普利组小鼠背部皮下注射ISO 3 mg/kg，每天1次，连续14 d;正常组皮下注射相应体积的生理盐水。每日上午注射ISO 4 h后，分别灌胃给予相应的药物，每日1次，连续14 d;模型组和正常组均灌胃给予等体积的0.5%CMC-Na。记录给药期间小鼠一般状况，所有小鼠于给药14 d后进行相关指标的检测。

1.4.3心脏重量指数测定 于末次给药的次日，放血处死小鼠，迅速开胸取出小鼠心脏，于预冷的生理盐水(4℃)中洗净余血，滤纸吸干，沿房室沟剪掉心耳、心室周围结缔组织，于电子天平上称取全心重量；然后紧贴室间隔右侧剪下右心室游离壁，剩余部分(包括室间隔)为左心室重量，分别计算全心重指数和左心室重量指数。

1.4.4心肌组织Hyp含量、氧化损伤和NOS系统相关指标测定 取左心室心肌组织，用冰生理盐水冲洗去血液，滤纸吸干，称质量后，加9倍生理盐水，在冰水浴中用玻璃研磨器研制成10%的匀浆，以3 500 r/min离心10 min，取上清液至于-20℃冰箱保存备用。心肌组织中Hyp、MDA和NO含量及SOD、GSH-Px、iNOS和cNOS活性的测定按试剂盒说明书方法进行。

1.4.5病理学指标观察 取左心室中段横截面心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，石蜡切片，然后分别进行HE和苦味酸-天狼星红染色。在HE染色切片中，测量400倍光镜下每个心肌细胞跨核的最窄直径和心肌细胞横截面积；在苦味酸-天狼星红染色中，心肌细胞呈黄色，胶原呈红色。用计算机图像分析，通过灰度调节区别胶原和非胶原成分，测量左心室的胶原容积分数(心肌胶原面积/所测视野面积)。每张切片各随机分析6个视野，并取平均值。

1.4.6心肌超微结构观察 每组随机选取3只动物的心脏的部分左心室心肌组织，迅速投入40.0 ml/L戊二醛与0.009 mol/L草酸钾混合固定液中4℃固定1.5 h，再用0.009 mol/L KH2PO4溶液洗涤15 min，然后切成薄片。此薄片用10.0 g/L四氧化锇和20.0 g/L焦锑酸钾混合液室温下固定2.0 h，再用pH 10.0蒸馏水洗涤15 min，再用乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铝双重染色后，透射电子显微镜观察。

2 结 果

2.1小鼠一般状况 正常组小鼠精神状态佳，反应敏捷，活动度好；造模后小鼠活动度减少，易激惹；开口箭不同提取部位组及阳性药卡托普利组则有所改善。

2.2开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心脏重量指数的影响 模型组小鼠全心和左心室重量指数明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，在改善全心重量指数方面，乙酸乙酯部位和正丁醇部位与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)，在改善左心室重量指数方面，水部位和乙酸乙酯部位、正丁醇部位与模型组比较具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)；阳性药卡托普利在改善全心和左心室重量指数方面与模型组比较均具有显著性差异(P<0.01)。实验结果表明，开口箭不同提取部位均可改善ISO致心肌肥厚小鼠心脏重量指数，其中以正丁醇和乙酸乙酯部位作用效果更为显著，特别是正丁醇部位组，其作用效果与卡托普利组基本相仿。见表1。

2.3开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌组织中Hyp含量的影响 模型组小鼠心肌组织中Hyp含量明显升高，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，其各部位能明显降低心肌组织中Hyp含量，与模型组比较，除石油醚部位组外，均具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。见表2。

表1 开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心脏重量指数的影响

表2 开口箭不同提取部位对心肌肥厚小鼠心肌组织中Hyp和氧化损伤指标的影响

2.4开口箭不同提取部位对心肌肥厚小鼠心肌组织中氧化损伤指标的影响 模型小鼠心肌组织中MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px活性显著降低，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，其石油醚部位对上述指标有一定的改善作用，其中对SOD活性的影响与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)；乙酸乙酯和正丁醇部位均可显著改善上述指标，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)，其中以正丁醇部位作用效果更为显著；水部位对上述指标也有一定的改善作用，其中对SOD和MDA活性的影响与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)；阳性药卡托普利在改善心肌氧化损伤指标方面与模型组比较均具有显著性差异(P<0.01)。见表2。

2.5开口箭不同提取部位对心肌肥厚小鼠心肌组织中NOS系统含量的影响 模型组小鼠心肌组织中iNOS、NO水平明显升高，cNOS活性显著降低，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，其石油醚部位和水部位对上述指标均有不同程度的改善作用，其中对cNOS活性和NO含量的影响与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)；乙酸乙酯和正丁醇部位均可显著改善上述指标，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)，其中以正丁醇部位作用效果更为显著；阳性药卡托普利在改善上述指标方面与模型组比较均具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。见表3。

表3 开口箭不同提取部位对心肌肥厚小鼠心肌组织中NOS系统含量的影响

2.6开口箭不同提取部位对心肌肥厚模型小鼠心肌细胞直径和横截面积的影响 正常组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐、结构清楚，无心肌纤维的破坏和炎性渗出，细胞胞核清晰、胞间间隙正常；模型组心肌组织可见心肌纤维束宽大和大量纤维化，心肌细胞直径和横截面积明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，心肌细胞肥厚程度，纤维化程度及心肌细胞直径和横截面积均有不同程度的改善；在降低心肌细胞直径方面，乙酸乙酯和正丁醇部位组与模型比较具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)；降低心肌细胞横截面积方面，开口箭四个不同提取部位与模型组比较均有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。见表4和图1。

表4 开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌细胞直径、横截面积和心肌间质胶原容积分数的影响

2.7开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌间质胶原容积分数的影响 心肌组织经苦味酸-天狼星红染色后，光镜下观察，可见心肌细胞呈黄色，胶原纤维呈红色。心肌间质胶原含量经半定量分析显示，模型组心肌间质胶原容积分数明显升高，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用开口箭不同提取部位治疗后，心肌间质胶原容积分数均有不同程度的降低，开口箭四个不同提取部位与模型组比较均有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。见表4和图2。

2.8开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌超微结构的影响 电镜下观察，可见正常组小鼠心肌肌原纤维排列整齐，肌节长度一致、排列规整，肌丝清晰；细胞核发育良好，核周围有大量线粒体；线粒体形状规则，结构清晰，内嵴排列紧密，无肿胀及空泡样变、水样变等。模型组心肌肌原纤维排列紊乱、模糊且有大量空泡，肌节缩短，排列不规整，肌丝溶解、消失，肌浆网扩张；可见细胞核异形变，异染色质边集，亦可见核内空泡样变及核膜模糊，核周细胞器呈点状、碎片状等变化；多数线粒体明显肿胀，线粒体内嵴松散分开，线粒体间糖原散在，闰盘排列紊乱，有断裂现象，心肌细胞内出现大量溶酶体。用开口箭不同提取部位治疗后，上述心肌细胞和心肌肌原纤维的异常改变得到了不同程度的改善，其作用效果以乙酸乙酯部位和正丁醇部位更为显著；在电镜下可见上述两个治疗组心肌病变的程度明显减轻，心肌肌原纤维排列较规整，肌节排列亦较为整齐，肌丝溶解较模型组明显减少，细胞核完整，线粒体肿胀明显减轻，线粒体内嵴的排列整齐。实验结果提示开口箭对ISO致小鼠心肌肥厚有较好的保护作用。见图3。

A：正常组，B：模型组，C：石油醚部位组，D：乙酸乙酯部位组，E：正丁醇部位组，F：水部位组，G：卡托普利组；下图同

图2 开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌间质胶原容积分数的影响(苦味酸-天狼星红，×200)

图3 开口箭不同提取部位对ISO致心肌肥厚小鼠心肌超微结构的影响(×60 000)

3 讨 论

心肌肥厚是心脏对冠心病、高血压等心血管疾病的一种病理状态的代偿反应，其表现为心肌细胞体积增大、细胞收缩蛋白成分改变和心肌间质细胞增生。初期心肌肥厚对机体是一种有益的适应性反应，其目的是平衡心肌应激能力的增加，减轻室壁压，实现短期维持心输出量，但长期应激所致的持续性心肌肥厚最终可导致扩张型心肌病、心力衰竭和猝死〔17～19〕，因此防治心肌肥厚有重要意义。尽管西医临床上可供选择的药物(如血管紧张素转化酶抑制药、血管紧张素受体阻断药、钙拮抗剂等)很多，因其对肝、肾、脾、胃等器官伤害较大，成为较为棘手问题。因此，国内外医药专家和患者都在努力寻找有效无毒的天然制品，使得当前中医药在心肌肥厚防治领域的日益受到国内外学者的关注。

开口箭作为土家族广为应用的民间草药，对中枢神经系统、消化系统、免疫系统和肿瘤防治及抗炎等均有较好作用〔7～12〕。近年来，随着笔者在其化学成分研究中大量强心苷类成分的发现，激发了笔者对其在心血管作用方面的关注，结合乐开礼等人〔13～15〕对其强心活性的报道和笔者前期实验结果，笔者设计了小鼠小剂量连续皮下注射ISO诱导心肌肥厚的实验。由于ISO为β受体激动剂，它一方面可加快心率、加速传导，心肌耗氧量明显增加，环磷酸腺苷生成和糖原合成增加，从而促进心肌细胞总蛋白和非收缩蛋白合成，使心肌收缩力增强，心率加快，导致心肌细胞肥大、胶原纤维增生，产生心肌肥厚；另一方面，由于循环和心脏局部儿茶酚胺含量增加，可引起脂质代谢异常及引起体内氧自由基(oxygen free radical，OFR)生成增加，使心肌受损和能量缺乏，进而导致心肌肥厚的发生发展，其具体表现为心肌细胞体积增大和细胞外基质胶原纤维大量沉积〔20〕。本实验结果显示，模型组小鼠心脏重量指数明显增加，心肌组织可见心肌纤维束宽大和大量纤维化，心肌细胞直径和横截面积明显增加，心肌间质胶原容积分数明显升高。实验结果也与文献报道一致〔21〕，提示心肌肥厚模型制作成功。用开口箭石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位治疗后，心脏重量指数、心肌细胞直径和横截面积、心肌间质胶原容积分数、心肌细胞肥厚程度明显降低，纤维化程度显著减轻，显示出了对心肌肥厚较好的保护作用。

综上所述，开口箭的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位均能升高ISO致小鼠心肌肥厚的心肌组织中SOD、GSH-Px和cNOS活性，减少Hyp、MDA、NO含量和iNOS活性，降低心肌细胞直径和横截面积，心肌间质胶原容积分数，使心肌细胞肥厚程度明显降低，纤维化程度明显减轻；在开口箭的四个提取部位中，其作用效果以正丁醇部位最为显著，其余依次为乙酸乙酯部位、水部位和石油醚部位。实验结果表明，清除OFR、抗脂质过氧化及逆转NOS系统异常的表达水平，提高机体的抗氧化能力可能是开口箭抗心肌肥厚的作用机制之一。

4 参考文献

1傅书遐，中国科学院武汉植物研究所.湖北植物志〔M〕.武汉：湖北科学技术社，2002：498-9.

2汪鋆植，邹 坤，徐宏伟.开口箭皂苷抗炎活性的研究〔J〕.时珍国医国药,2006；1(10):1970-1.

3江苏新医学院·中药大辞典，上册〔M〕.上海：上海科学技术出版社，1985：907.

4申玲玲,杜 光.开口箭属植物化学成分与药理作用研究进展〔J〕.医药导报，2010；29 (7)：869-71.

5Liu CX，Guo ZY，Xue YH,etal.Tupisteroide A-C，three new polyhydroxylated steroidal constituents from the roots of Tupistra chinensis〔J〕.Magn Reson Chem，2012；50(4)：320-4.

6Liu CX，Guo ZY，Xue YH,etal.Five new furostanol saponins from the rhizomes of Tupistra chinensis〔J〕.Fitoterapia，2012；83 (2):323-8.

7李小莉，张迎庆，洪蓓蓓.民间草药开口箭的抗炎镇痛作用的研究〔J〕.湖北中医学院学报，2005；7(4):28-9.

8邱 教，董卫国.开口箭提取物对大鼠实验性结肠炎的治疗机制研究〔J〕.山东医药，2005；45(26):4-6.

9解 燕，朱正光，余传林，等.开口箭酸性多糖对小鼠免疫功能的调节作用及抗肿瘤作用的初步研究〔J〕.中药材，2010；33 (4):596-9.

10李 青,邹 坤，汪鋆植.开口箭提取物体外抗肿瘤实验研究〔J〕.中国民族民间医药杂志， 2007；86(3):164-7.

11徐兰兰，邹 坤,汪鋆植，等.开口箭提取物治疗急性咽炎的实验研究〔J〕.江苏中医药，2008；40(8)：78-9.

12Huang WF，Zhang HQ，Zou K,etal.Total saponins of Tupistra chinensis induces apoptosis in A549 cells〔J〕.Neoplasma，2012；59(6)：613-21.

13乐开礼,杨德馨，周云仙.须瓣开口箭的病理研究(Ⅰ强心作用与生物活性测定)〔J〕.药学研究，1963；10 (1)：39-43.

14乐开礼，周云仙.须瓣开口箭的病理研究(Ⅱ强心作用药理、蓄积性、显效速度与治疗指数)〔J〕.药学研究，1963；10(12)：745-50.

15邓士贤，张子昭，李存德，等.黄花开口箭(Tupistra aurantiaca Wall.)的强心作用〔J〕.药学研究，1963；12(12)：788-92.

16Maulik SK，Prabhakar P，Dinda AK,etal.Genistein prevents isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in rats〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2012；90(8):1117-25.

17吴庆玲，周祖玉，徐建国.黄连素对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚的影响〔J〕.现代中西医结合杂志，2008；17(3)：1956-8.

18Ryall KA，Holland DO，Delaney KA,etal.Network reconstruction and systems analysis of cardiac myocyte hypertrophy signaling〔J〕.J Biol Chem，2012；287 (50):42259-68.

19Bi Q.Outline of proteins and signaling pathways involved in heart failure 〔J〕.Curr Protein Pept Sci，2012；13 (7):682-6.

20张乡城，薛金雄，杨晓光，等.拳参正丁醇提取物对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚的保护作用〔J〕.时珍国医国药，2008；19 (7):1665-6.

21Satoh K，Nigro P，Zeidan A,etal.Cyclophilin A promotes cardiac hypertrophy in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011；31 (5):1116-23.

22Misra MK，Sarwat M，Bhakuni P,etal.Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes〔J〕.Med Sci Monit，2009；15(10)：RA209-19.

23Ansley DM，Wang B.Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart〔J〕.J Pathol，2013；229(2):232-41.

24Maulik SK，Prabhakar P，Dinda AK,etal.Genistein prevents isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in rats〔J〕.Can J Physiol Pharmacol，2012;90(8):1117-25.

25Umar S，van der Laarse A.Nitric oxide and nitric oxide synthase isoforms in the normal，hypertrophic，and failing heart〔J〕.Mol Cell Biochem，2010；333(1-2):191-201.