中国维吾尔族、汉族人群CD40L单核苷酸基因多态性与急性冠脉综合征的相关性

买尼沙·买买提 刘冬青 孟宪明 叶 珏 张燕婉 程祖亨 帕提曼·买买提 牙合甫江 高方明 帕尔哈提 杨跃进

(新疆医科大学第一临床医学院心脏中心，新疆 乌鲁木齐 830011)

炎症反应是急性冠状动脉综合征(ACS)斑块易损的关键因素〔1，2〕。CD40-CD40L系统作为免疫和炎症反应的枢纽，几乎贯穿ACS全过程，对斑块的破裂起着关键作用，可能刺激血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞产生与动脉粥样硬化(AS)有关的生物活性因子，如选择素、细胞因子等，参与AS斑块形成及破裂〔3〕。目前认为CD40L是各种免疫炎症反应调节的信号通路，参与AS斑块内主要细胞成分的炎症反应调节〔4，5〕。流行病学研究表明，遗传基因在冠心病发病中可能起重要作用，但引起冠心病的分子机制迄今仍不明确。目前CD40L基因的单核苷酸多态性(SNP)与ACS的相关性研究刚起步，国内外关于CD40-CD40L多态性检测的相关报道大多采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法〔5〕，更未见在维吾尔族与汉族之间对比研究。

1 对象与方法

1.1对象 380例研究对象，110例维吾尔族患者来自2009年1至2010年1月在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院、新疆维吾尔自治区中医医院、喀什地区人民医院、喀什地区第二人民医院接受冠状动脉介入治疗的ACS住院患者；40例同时期进行冠状动脉造影检查的患者为维吾尔族稳定型心绞痛(SAP)组，40例体检正常的维吾尔族人为正常对照组。110例汉族患者来自同时期在北京阜外心血管病医院接受冠状动脉介入治疗的ACS住院患者；设立40例同时期进行冠状动脉造影检查的患者为汉族SAP组；40例体检正常的汉族人为正常对照组。正常对照组排除心脏病变和器质性疾病，并排除急性感染、创伤或手术2 w以内者、合并脑血管意外或外周血管疾病、肝、肾功能不全、恶性肿瘤、慢性结缔组织病。

采集受试对象的临床资料，主要包括临床表现、体质量指数(BMI)、高血压病史、吸烟史、糖尿病史、血脂异常、脑血管病、冠心病及周围血管病、用药史和家族史等以及体格检查、实验室检测、心电图、超声心动图检查。血压测定采用经矫正的汞柱式血压计，在采血前测量，测量前静坐 5 min，禁止吸烟。测坐位右上臂血压，重复测 2 次，取平均值等。测定空腹血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等生化指标。

纳入标准：①符合ISFC/WHO公布的冠心病诊断标准并经冠状动脉造影证实；②知情同意。研究采用标准：ACS的诊断采用2004 年《美国ST 段抬高心肌梗死诊断及治疗指南》〔6〕的标准，2007 年《美国不稳定心绞痛及非 ST 段抬高心肌梗死诊断及治疗指南》〔7〕的标准；血脂异常的诊断采用我国 2007 年的《中国成人血脂异常防治指南》〔8〕的标准；高血压的诊断采用 2004 年《中国高血压防治指南(实用本)》〔9〕；糖尿病的诊断采用我国 2007年的《中国糖尿病防治指南》〔10〕；BMI 分级标准采用我国 2004 年中国肥胖问题工作组的建议〔11〕。排除标准：心肌炎、心肌病、心内膜炎、风湿性心脏病等心脏疾病；自身免疫病；肿瘤；肝硬化及其他重要脏器病变；1个月内有感染、使用抗炎药物及近期手术者；各组ACS患者与非ACS患者年龄、性别构成比、左室射血分数、高血压、糖尿病无显著差异。

1.2仪器与材料 主要仪器：冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、台式低速、高速离心机、电热恒温水浴箱、7300型实时荧光定量PCR仪、微量移液器、紫外分光光度仪等。试剂：检测血CD40L的ELISA试剂盒(美国R&DSystems公司)、CD40L检测位点的TaqMan 探针；CD40L SNP基因分型试剂(SNP Genotyping Assay Mix)；CD40L用TaqMan 通用 PCR 扩增预混试剂(TaqMan Universal PCR Master Mix)；MicroAmp 光学96孔反应板(MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate)等均由美国应用生物系统公司提供。人类基因组DNA提取外周静脉血5 ml，采用盐析法提取人白细胞基因组DNA。

1.3检测方法 (1)使用专用抗凝管空腹采血，血样本在室温下以3 000 r/min离心15 min，提取上层血清分装于不同试管中，置于-70℃冰箱中保存备检。用ELISA法检测sCD40L。ELISA试剂盒由美国R&DSystems公司提供。所有操作均按说明书完成。(2)使用美国ABI公司提供的7300实时荧光PCR仪检测CD40L-3459A>G位点SNP。PCR反应体系成分为dH2O体积为256.25 μl；2× TaqMan Universal PCR Master Mix为375 μl；DNA为100 μl；40×SNP Genotyping Assay Mix(CD40L)为18.75 μl；PCR扩增高聚：95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min共40个循环。

1.4冠状动脉狭窄程度的计算 由心脏内科专业医师进行冠状动脉造影，入路途径为经股动脉或经桡动脉途径。左冠状动脉至少投照四个体位，右冠状动脉至少投照两个体位，必要时加其他体位至冠状动脉各段能够充分显示。采用美国冠状动脉手术研究(CASS)诊断标准和Gensini评分标准〔12〕，狭窄≤25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为4分，75%～90%为8分，90%～99%为16分，100%(闭塞)为32分。不同节段冠状动脉评分系数按Gensini标准，每例患者冠状动脉病变程度的最终积分为各分支积分之和。冠脉狭窄的严重性按Gensini评分评估。狭窄程度评分再乘以相应系数后得出最终分数。

2 结 果

2.1一般资料比较 无论是维吾尔族还是汉族，对照组与ACS组在性别、年龄和左室射血分数两组无显著差别(P>0.05)。ACS组BMI高于对照组。ACS组中吸烟并伴有高血压病、糖尿病和/或高胆固醇血症的比例显著高于对照组。维吾尔族和汉族一般临床资料比较，两民族间未见显著性差异。无论是汉族还是维吾尔族，预防性服用他汀类及对氨基水杨酸类药物的意识低。见表1。

表1 维、汉各组研究对象一般临床资料

2.2维吾尔族及汉族ACS组与对照组 CD40L 基因-3459A>G多态性基因型及等位基因频率的比较 本研究SNP位点在各组中分别均符合Hardy-Weinberg平衡。-3459A>G基因型、-3459G等位基因在汉族健康对照者和ACS患者之间差异有显著性(P<0.05)；-3459A>G基因型和-3459G等位基因在维吾尔族健康对照组和ACS组之间差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 维吾尔族、汉族ACS组与对照组 CD40L 基因-3459A>G SNP位点基因型分布和等位基因频率

2.3CD40L SNP位点与冠状动脉AS病变支数之间的关系 无论是维吾尔族还是汉族冠心病患者，不同基因型间冠状动脉病变支数存在显著性差异(P<0.05)。汉族、维吾尔族均是 GG 基因型与冠状动脉病变支数有显著相关性。见表3。

表3 维吾尔族、汉族ACS、SAP、对照组患者冠状动脉病变支数与-3459A>G SNP的相关性

2.4CD40L SNP位点与冠状动脉AS病变之间的关系 -3459A>G多态性位点中CD40LG基因在不同冠状动脉病变评分数组其少见等位基因频率及基因型频率差异有统计学意义(P>0.05)。随着评分的增加，CD40LG基因的出现频率也增加，也就是说维吾尔族、汉族ACS患者CD40LG基因与冠脉病变的严重程度具有相关性。见表4。

表4 维吾尔族、汉族ACS、SAP患者冠状动脉病变Gensini评分与CD40L-3459A>G SNP的相关性

2.5CD40L基因多态性及血sCD40L 水平对冠状动脉病变程度的影响 不论是维吾尔族还是汉族ACS患者不同基因型间血sCD40L水平与冠状动脉评分存在显著性差异(P<0.05)。不论是维吾尔族还是汉族ACS患者，均以 GG 基因型的 sCD40L 水平最高，冠状动脉病变程度最严重将维吾尔族及汉族人群以冠状动脉病变积分分为：高分组与低分组；与血清sCD40L 水平以三位数为界分为sCD40L高值组和sCD40L低值组，结果显示，在校正了高TC、高血压、高尿酸、糖尿病和吸烟等危险因素后，血清 sCD40L水平与CD40L G 基因多态性以及冠状动脉病变程度显著相关。见表5。

表5 CD40L A>G 基因 SNP及血清 sCD40L 水平与ACS患者冠状动脉病变程度的相关性

2.6维吾尔族、汉族患者ACS危险的多因素分析 结果见表6。以性别(男=1，女=0)，年龄(≥60岁=1，<60岁=0)、高血压(有=1，无=0)、糖尿病(有=1，无=0)、BMI(>25=1，≤25=0)、CD40L-3459A>G等位基因(AG、GG=l，AA=0)作为自变量(X)，血脂等指标分为不同的等级：TC(<5.2 mmol/L =0，5.2～5.7 mmol/L=1，≥5.7 mmol/L=2)、TG(≤1.7 mmol/L=0，1.8～2.3 mmol/L=1，≥mmol/L=2)、HDL(<0.90 mmol /L=0，0.9～1.03 mmol/L=1，≥1.03 mmol/L=2)、LDL-C(<3.1 mmol/L=0，3.1～3.6 mmol/L=1，≥3.6 mmol/L=2)；LP(a)(<30=1，≥30=2)；CRP(<1.1 mg/L=0，1.0～3.0 mg/L=1，≥3.0 mg/L=2)；IL-6(<20 pg/ml=0,≥20 pg/ml=1)；sCD40L(<2.9 ng/ml=0, ≥2.9 ng/ml=1)作为自变量(X)，将是否患有ACS作为应变量Y(患病=1，未患病=0)。结果显示，TC、lp(a)、年龄、TG、性别、高血压、糖尿病、sCD40L、IL-6是本研究对象ACS发生的独立的危险因素。不论维吾尔族还是汉族ACS患者，Logistic 回归校正性别、年龄、MBI、高血压病、糖尿病、高TC血症及吸烟等冠心病易患因素后，CD40L G基因多态性是冠心病发病的独立的危险因素(P<0.05)。

表6 维吾尔族、汉族急性冠脉综合征的Logistic回归分析结果

3 讨 论

CD40/CD40L是一对互补跨膜糖蛋白，是免疫和炎症反应中重要的信号转导途径。CD40L也称CD154，是肿瘤坏死因子超家族的成员之一，基因定位于Xq26.3～q27.1区，跨度大约13 kb，包含5个外显子和4个内含子。血小板活化时，储存在 α 颗粒内的CD40L 可以很快移行到血小板表面，脱落成为可溶的CD40L(sCD40L)〔12，13〕。无论是膜结合形式还是sCD40L，都能与CD40 结合，启动相应的免疫、炎症反应〔14〕。斑块的肩部是炎症的好发部位，炎症反应贯穿于AS从脂纹的形成到斑块、斑块破裂和血栓形成的全过程，在一定程度上决定着AS斑块的稳定性和自然进程。体外研究〔15〕已证实CD40L可刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表达和释放基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-9等一系列蛋白酶，通过激活MMPs从而促进斑块易于破裂，同时刺激促炎因子，如白细胞介素(IL)-1a，IL-10，IL-6、γ-干扰素(IFN-γ)等大量释放〔16〕，激活细胞的凋亡、损坏内皮细胞，引起激烈的炎症反应，进而CD40/CD40L与炎症反应之间形成恶性循环，导致易损斑块的破裂。国外Mälarstig等〔17〕在北欧人群2 359例非ST段抬高的ACS病人中进行随机对照的前瞻性研究报道(对CD40L的6个SNP位点进行了检测)CD40L-3459 A﹤G SNP决定血浆CD40L的水平，增加细胞表面CD40L的表达，而且增大与CD40间的相互作用，预示心肌梗死。CD40-CD40L与斑块的不稳定及ACS粥样斑块主要由血管平滑肌和炎症细胞以及细胞外基质所组成，可分为稳定斑块和不稳定斑块。CD40及CD40L主要分布在斑块的“肩部”，即斑块与正常组织的交界处，能刺激粥样斑块相关细胞表达和产生一系列与斑块破裂和血栓形成有关的活性物质。

研究表明〔18〕，AS同样与遗传因素密切相关。现在普遍认为AS是一种多基因疾病，SNP是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性，是导致人体许多表型差异、对药物反应或疾病的易感性差异的重要原因之一。目前已鉴定的与疾病易感性有关的功能性SNP多定位于蛋白质编码区，功能性SNP主要通过改变蛋白质的氨基酸序列(如编码区的SNP)或在转录水平导致mRNA表达发生变化(如位于基因调控序列内的SNP)而发挥作用〔19〕。近年来越来越多研究发现，编码合成人类CD40/CD40L的基因也存在SNP，这些SNP与包括AS在内的一系列自身免疫性疾病和心血管疾病的易感性相关〔5〕。Jacobson 等〔20〕认为CD40 基因 Kozak 序列多态性可提高 CD40 翻译效率，从而影响 CD40 水平。还有文献〔21〕报道CD40-E1SNP(-1C/T)正位于Kozak序列，C 等位基因可提高 CD40 的翻译效率。国外文献〔17〕报道，CD40L G基因是瑞典人群预测急性心肌梗死的易感基因，且与sCD40L升高有相关性。本研究并未发现A等位基因与ACS的相关性。本研究中 G 等位基因型显著增高血清sCD40L 水平，G 等位基因携带者冠状动脉病变程度也较严重。

随着评分的增加，CD40LG基因的出现频率也增加，即维吾尔族、汉族ACS患者CD40LG基因与冠脉病变的严重程度具有相关性。CD40LG 等位基因与维吾尔族与汉族ACS可能相关。可能是这两民族ACS的易感因子是冠脉粥样斑块糜烂或破裂的易感因子，而与冠脉病变程度有一定的相关性。CD40LG 等位基因可能与维吾尔族和汉民族ACS性CD40L高表达有相关性。在研究中，虽然对入选研究对象的性别和年龄进行了匹配，但仍有其他潜在的混杂因素未能很好地控制；本研究存在入选人群的种族、地区差异等局限性，因此尚不能提供全面充分的证据来证实维吾尔族、汉族CD40L-3459A>G多态性与ACS发病的确切关系。期待将来能有大样本、多中心、前瞻性的研究，并在多地域、多种族人群中进行群体遗传学的复制试验，进一步揭示基因多态性与疾病的关系。

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