前列腺增生和前列腺癌患者组织前列腺特异性抗原mRNA水平

马 雷 高英英 辛 华 王光彦

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

近年来，前列腺癌(PCa)已成为危害中国男性健康的主要疾病之一〔1〕。前列腺特异性抗原(PSA)作为PCa的筛查、诊断、治疗、监测和良性前列腺疾病的鉴别诊断的主要指标〔2〕已被广泛推广使用。正常情况下，PSA被排泌到前列腺导管内，成为精液的一部分，只有很少量进入血液中。但是在前列腺的恶性肿瘤、前列腺增生(BPH)和前列腺炎症时PSA都可以明显升高。PCa和BPH患者外周血PSA值的重叠交叉造成了不必要的前列腺活检〔3〕。实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术一直以来PSA mRNA的测定都处于定性和半定量的水平，而RT-PCR技术则达到了完全定量水平。本文应用RT-PCR技术测定PCa、BPH伴炎症和不伴炎症患者前列腺组织中的PSA mRNA含量，以期研究分析外周血PSA水平和良恶性疾病前列腺组织生成PSA能力的关系，旨在探讨良性BPH伴炎症和不伴炎症患者前列腺组织PSA mRNA水平和外周血PSA含量的关系。

1 材料与方法

1.1病例资料 选自2007～2011年佳木斯大学第一附属医院泌尿外科住院病人。PCa组22例，由于外周血PSA值升高、前列腺彩超、CT、MRI结果异常，初诊为可疑PCa，后经前列腺穿刺活检，病理确诊为PCa，年龄60～87〔平均(70±9.7)〕岁。BPH组38例，由于排尿困难就诊，经前列腺彩超、CT、MRI检查诊断为BPH。需要做经尿道前列腺电切术(TURP)治疗入院，病理确诊为BPH，年龄48～87〔平均(67±8.7)〕岁。

所有病例均进行全部入院检查，包括肛门指诊、外周血PSA、f-PSA、彩超、CT和MRI检查。留取前列腺穿刺活检标本和TURP切除组织，置入冻存管中，保存在液氮罐中，并尽快保存在-80℃超低温冰箱中。

1.2仪器及材料 总RNA提取RNAiso试剂盒、白血病病毒(MMLV)逆转录酶、溴乙啶、焦碳酸二乙酯(DEPC)购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由上海生物工程服务技术有限公司合成RT-PCR试剂盒：中山大学达安基因股份有限公司。PSA、f-PSA试剂盒：罗氏诊断产品(上海)有限公司。RT-PCR 分析仪：Applied Biosystems 7300 RT-PCR system。外周血PSA、f-PSA分析仪器(电化学发光法)：HITACHI Elecsys 2010。

1.3外周血的提取 采血前避免影响PSA和f-PSA的因素，保证结果的准确性，抽取空腹静脉血(各项检查前)5 ml，立即2 000 r/min离心10 min，分离外周血置-20℃保存，1 w内完成实验。

1.4引物序列 PCR引物：上游：5′-CACTGCATCAGGAACAAAA-3′，下游：5′-CTCATATCGTAGAGCGGGT-3′。β-actin 上游：5′-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游：5′-GAACTTTGGGGGATGCTCGC-3′，扩增目的片段长度为712 bp。

1.5前列腺组织总RNA提取

1.5.1防止RNA分解酶的破坏和污染 实验中使用的一次性塑料制品均购买经0.1%DEPC水处理过的RNA实验专用器材。所有试剂、器械和三蒸水都经0.1%DEPC水隔夜处理，又经过120℃ 60 min高温高压处理。实验过程中避免交谈，防止唾液中的RNA分解酶破坏RNA。

1.5.2总RNA的提取 严格按照RNAiso试剂盒中的操作程序进行。组织研磨时要彻底，以无可见的明显颗粒为准，充分的研磨可以保证RNA的提取率和质量。RNAiso reagent与组织块的比例为1∶1。氯仿乳化时一定要充分，直到无分相现象。RNA 沉淀清洗时尽量除净乙醇，减少RNA 中的盐离子含量，并要求室温干燥，不能加热干燥。RNA 沉淀完全溶解于DEPC处理水中后，于-80℃保存。

1.6总RNA质量鉴定 用1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。RNA纯度和浓度用紫外分光光度计下测OD260、OD280值。取OD260/OD280值在1.8～2.0范围内的标本进行逆转录。

1.7cDNA合成 反应体系为总RNA 2 μl，MgCl23 μl，10×RT缓冲液2 μl，RNase Free dH2O 9.5 μl，dNTP混合液1 μl，RNase抑制剂0.5 μl，AMV逆转录酶1 μl，Oligo dT-Adaptor Primer 1 μl；反应条件为：30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。cDNA保存于-20℃冰箱待用。

1.8实时PCR 反应体系为：TaqDNA聚合酶 0.5 μl，MgCl24 μ1，5×PCR缓冲液 5 μ1，dNTP 4 μl，PSA上、下游引物各2 μl，cDNA 5 μ1，灭菌蒸馏水 27.5 μl；溶解曲线出现单一波峰说明扩增产物单一，无非特异性扩增产物。反应条件：孵育：94℃ 120 s，循环1次；扩增：94℃ 25 s,65℃ 30 s,72℃ 30s，45个循环，延伸阶段结束时收集荧光信号；溶解曲线：65℃ 1 s,94℃ 20 s,循环1次，在温度缓慢升高过程中收集荧光信号。

1.9外周血PSA的检测 PSA定量检测采用电化学发光法，使用仪器为HITACHI Elecsys 2010，由专业工作人员测定。

2 结 果

2.1BPH组、PCa组检测结果比较 血PSA浓度在BPH组〔(5.831±6.753)ng/ml〕和PCa组〔(98.232±129.124)ng/ml〕比较差异显著(P<0.01)，组织PSA mRNA表达量在BPH组〔(59.845±132.017)拷贝数〕和PCa组〔(20.23±28.223)拷贝数〕比较无显著性差异(P>0.05)。

2.2无炎症BPH组与合并炎症BPH组检测结果比较 血PSA浓度在无炎症BPH组〔(6.234±7.814)ng/ml〕和合并炎症BPH组〔(6.929±5.477)ng/ml〕比较无显著性差异(P>0.05)。组织PSA mRNA表达量在无炎症BPH组〔(59.231±123.458)拷贝数〕和合并炎症BPH组〔(74.866±148.258)拷贝数〕比较无显著性差异(P>0.05)。

2.3PCa组外周血PSA和组织PSA mRNA定量结果和临床参数的关系 PCa组外周血PSA在3种年龄分组中总体比较无显著性差异(P>0.05)；在3种临床分期中总体比较差异显著(P<0.05)；在3种Gleason评分中总体比较无显著性差异(P>0.05)。PCa组组织PSA mRNA定量检测在3种年龄分组中总体比较无显著性差异(P>0.05)；在3种临床分期中总体比较无显著性差异(P<0.05)，临床分期B期和C、D两期组间比较差异显著(P<0.05)；在3种Gleason评分中总体比较无显著性差异(P>0.05)，Gleason评分8～10分组和5～6分组、5～7分组两组组间比较差异显著(P<0.01)，见表1。

表1 PCa组外周血PSA和组织PSAmRNA定量结果和临床参数的关系

2.4三种疾病分组组织PSA mRNA表达量和外周血PSA水平的相关性分析 无炎症BPH组前列腺组织PSA mRNA表达量和外周血PSA水平具有相关性(r=0.614，P=0.001) 。合并炎症BPH组前列腺组织PSA mRNA表达量与外周血PSA值无相关性(r=0.295,P=0.324)。PCa组组织PSA mRNA表达量与外周血PSA值无相关性(r=0.325,P=0.457)。

3 讨 论

对于前列腺，外周血PSA指标十分特异，现已成为前列腺疾病尤其是PCa的主要标志物〔4,5〕。大部分PCa病人的外周血PSA会出现明显的增高，可是在不同发病原理的诱导下，前列腺炎和BPH病人同样会出现外周血PSA不同程度的升高。这样良、恶性前列腺疾病的外周血PSA水平出现了一定的重叠，使得PSA作为恶性前列腺疾病的标志物的用途受到了影响。虽然PSA的特异性在前列腺上皮细胞内产生，对前列腺组织定量检测PSA可以反映前列腺细胞生成它的能力，但由于在各种前列腺良、恶性疾病时，少量PSA可以泄露到外周血中，使得这种测定准确性不高。而PSA mRNA是PSA的信使基因，是PSA合成的关键蛋白，对PSA的特异性、相关性非常高，测定前列腺组织PSA mRNA可以间接反映上皮细胞生成PSA的能力。虽然外周血中PSA mRNA也会有一定的泄露，但是其离开前列腺上皮细胞就失去了转录成PSA的环境，对测定前列腺组织生成PSA能力的影响十分微弱。本研究大大提高了定量结果的准确性。

本研究发现合并炎症组的PSA生成能力比无炎症BPH组要高，但无显著性差异。这可能是因为前列腺组织受到炎症的刺激，诱导其增殖能力增强，抑制其正常的细胞凋亡程序，从而导致前列腺上皮细胞内的PSA含量增多。本研究在基因水平证明低分化PCa细胞PSA生成能力下降。

本实验对三种疾病分组的组织PSA mRNA表达量与外周血PSA水平的相关性进行了分析，结果显示在无炎症BPH组中二者有明显的相关性，而在合并炎症BPH组和PCa组中，二者无明显的相关性。这可能由于这两组外周血PSA含量增高的途径相似，都是前列腺上皮细胞内的PSA 泄露到细胞外引起。可这两种疾病导致泄露的机制可能完全不同，PCa的前列腺组织基底膜受到癌细胞的侵袭而残缺不全，失去屏障作用，即使前列腺组织的PSA生成能力变化不大，而外周血PSA水平却明显升高。合并炎症BPH组的外周血PSA的升高可能是因为炎症引起了一系列的炎症反应，如细胞损伤、变态反应等，使前列腺细胞遭到破坏，而造成PSA的泄露。

4 参考文献

1Dijkman GA,Debruyne FM.Epidemiology of prostate cancer〔J〕.Eur Urol,1996；30(3):281-95.

2Umekita Y,Hiipakka RA,Koklontis JM,etal.Human prostate tumor growth in athymic mice-inhibition by androgen and stimulation by finasteride〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996；93(2):11802-7.

3Rippey JH,Wener MH,Horoszewicz J,etal.Workgroup standardization of PSA 〔J〕.Cancer,1993;71(8):2678.

4汪志伟,林成楚,李 毅,等.老年前列腺手术前后血清游离/总PSA水平变化及意义〔J〕.中国老年学杂志,2010；30(9):1282-3.

5张幕淳,计国义,孔祥波,等.血清fPSA对老年前列腺癌诊断的应用价值〔J〕.中国老年学杂志,2004；24(6):502-4.