吡格列酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用的研究

曹纪源++陈健

[摘要] 目的 研究吡格列酮（PGZ）对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响。方法 设不同浓度 PGZ 组 （0.01、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 mol/L）、不加药为对照组，应用MTT 法检测PGZ对胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制作用。 结果 与对照组比较，不同浓度的PGZ （0.1、1.0、10.0、50.0、 100.0mol/L）经 12h、24h、48h、72h 的作用后，不同浓度胃癌细胞 SGC-7901 吸光度均有显著性差异（P<0.05）。除0.01 mol/L PGZ对胃癌细胞SGC-7901 增殖没有明显的抑制作用（P>0.05），其它各剂量组对胃癌细胞SGC-7901增殖有明显的抑制作用，不同作用时间比较有显著性差异（P<0.05）。结论 PGZ可以明显的抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，且存在剂量-时间的关系。

[关键词] PGZ；胃癌细胞株；SGC-7901；增殖；MTT

[中图分类号] R735.2[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）18-0004-04

Effect study of anti-proliferation on pioglitazone of human gastric cancer SGC-7901 cells

CAO Jiyuan1 CHEN Jian2

1.Pharmacy Department， Ningbo Beilun Xiaogang Hospital，Ningbo 315801，China；2.Zhejiang University，Hangzhou 310027，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of anti-proliferation on pioglitazone of human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Different concentrations of PGZ groups （0.01，0.1，1.0，10.0，50.0 and 100.0 mol/L） were set up， control group were without drugs. The anti-proliferation effect of PGZ on human gastric cancer SGC-7901 cells were detected by MTT method. Results Compared with the control group，the OD value of gastric cancer SGC-7901 cells through different concentrations PGZ（0.1，1.0，10.0，50.0 and 100.0 mol/L） incubating 12，24，48，72 h were higher，the differences were significant（P<0.05）. The concentration of 0.01 mol/L PGZ had no significant inhibition on the proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells（P>0.05），the other dose groups had significant effect of inhibition on the proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells，compared with the control group，the differences were significant（P<0.05）. Conclusion The PGZ is capable of inhibiting proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in vitro significantly， and the result of inhibiting proliferation rate shows a significant dose-time relationship.

[Key words] Pioglitazone; Human gastric cancer; SGC-7901;Proliferation; MTT胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，是我国癌症发病和死亡的首位恶性肿瘤，近年来胃癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，己成为严重威胁我国人民生命健康的重大疾病。我国防治胃癌的形势十分严峻。目前有关胃癌的发生和发展的机制尚不十分淸楚。手术切除、放化疗以及免疫疗法是其主要的治疗方法，但传统化疗药物的客观反应率仅为24%~40%[1-2]，寻找治疗胃癌的药物和治疗方法是目前抗肿瘤研究亟待解决的关键问题。过氧化物酶增殖因子活化受体 γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPAR γ）属于配体依赖性核激 素受体，它存在于脂肪组织和免疫系统中，它对脂肪形成以及免疫反应发挥着重要的作用。近年来的研究发现[3]，PPAR γ在脂肪肉瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃 癌等恶性肿瘤中均有表达。与PPAR-γ相关的配体如吡格列酮（pioglitazone， PGZ）、罗格 列酮（ciglitazone）、环格列酮（ciglitazone）等作为一类抗糖尿病新药在临床上已得到应用[4]。而PGZ 是PPAR-γ的高亲和力配体，能竞争性与PPAR-γ结合，具有潜在的抗肿瘤作用。因此，2011~2013年本研究通过运用体外实验探讨PGZ对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响，从而为其在临床上治疗胃癌提供新的治疗方法及理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

人胃癌细胞SGC-7901由上海细胞资源中心提供。胰蛋白酶系、四甲基偶氮哇蓝（MTT）， RPMI-1640培养液（内含0.1%青霉素、链霉素）、二甲基亚枫（DMSO）均为美国Solarbio公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，碘化丙啶（PI） 购于南京晶美生物技术公司，PBS缓冲液（1X）购自北京索莱宝科技有限公司。PGZ为中美华东制药公司产品，用DMSO配成10～20 μmol/L原液，-20℃冻存，使用时用细胞培养液稀释至终浓度，培养液中DMSO终浓度< 0.1%。

1.2仪器

SW-CJ-IBU超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），MCO-175 CO2 培养箱（日本三洋产品〉，HT6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司产品）， CKX-31倒罝相差显微镜（日本OlymPys公司产品），低温台式离心机（Eppendorf公司）， Bio-RAD550全自动酶标读数仪（美国伯乐公司）等。

1.3实验方法

将人胃癌细胞SGC-7901常规培养于含10%新生牛血淸的RPM1-1640培养液中， 罝37℃、5%的CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于本实验。将对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901用0.25%胰酶消化后配制成浓度为2.6×103的细胞液，接种于96 孔培养板中，贴壁24h后分别加0.01、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 mol/L的PGZ，未加药物为对照组。对照组加入等体积细胞液，每个浓度设3复孔，继续培养12、24、48、72h后每孔加 入0.5% 20 μL MTT，继续培养4 h，弃去孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡混匀后， 在自动酶标检测仪测定每孔在570 nm处的吸光度（OD），根据OD值判定药物对细胞增殖的影响。计算细胞生长抑制率（IR）[5]，IR=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%，并计算IC50。

1.4 统计学方法

单因素方差分析比较各组间差异，结果采用均数±标准差（x±s）表示，运用统计学软件包SPSS21.0分析处理上述数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组作用不同时间后胃癌细胞SGC-7901吸光度比较

与对照组比较，不同浓度PGZ作用12 h、24 h、48 h、72 h后癌细胞SGC-7901吸光度均表现为下降的趋势，不同浓度的PGZ （0.1、1.0、10.0、50.0、100.0mol/L）经不同的作用时间后，各组不同浓度胃癌细胞SGC-7901吸光度进行F检验，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结果见表1 、封三图2。

2.2各组作用不同时间后对胃癌细胞SGC-7901增殖抑制的影响

除0.01mol/L PGZ对胃癌细胞SGC-7901增殖没有明显的抑制作用（P>0.05），其它各剂量组对胃癌细胞SGC-7901 增殖有明显的抑制作用，各组不同作用时间采用F检验，差异均具有统计学意义（P<0.05）。PGZ对胃癌细胞SGC-7901 的增殖抑制作用随着用药剂量和作用时间的增加而提高，表现出剂量和时间的依赖性关系，结果见表2、封三图3。

3讨论

3.1 胃癌及其治疗概述

胃癌是癌症中比较常见的一种，己构成严重危害人类健康的重大疾病，在我国的发病率居于各类肿瘤首位，引发的死亡人数极多，约占恶性肿瘤死亡人数的25%，且近年来，其检出率呈现逐年上升的趋势。目前，临床还没有完全阐明其病因，猜测饮食习惯、环境因素等可能直接而深刻地影响着其发病，同时，HP感染、胃黏膜异性增生等癌前病变也可能直接而深刻地影响着其发病。根治性切除手术是胃癌首要的治疗方法，但由多数患者确诊时己进入晚期而失去了手术治疗的最佳时期。对这类患者多以化疗为主。近年来研究表明PPAR-γ在肿瘤组织中呈上调表达， PPAR-γ配体激活PPAR-γ后具有抗肿瘤、促进细胞分化、诱导细胞凋亡的作用[6~7]。PPAR-γ在胃癌细胞中亦呈现高表达，有望成为预防、治疗胃癌的新位点。

3.2 PPAR-γ配体在胃癌化疗中的应用

过氧化物酶增殖物激活受体（PPARs）属于核转录因子家族，激活主体为配体，在贮存脂肪及代谢中具有至关重要的作用。PPARs 可以分为三种亚型，即PPAR α、PPAR γ、PPAR e，且三者均具有独立的基因编码。其中PPAR-γ最具脂肪组织特异性，现阶段临床已经对其进行了最为广泛和深入的研究。PPAR-γ最早发现于脂肪细胞的分化中，并在脂肪细胞的形成、分化等方面发挥着至关重要的作用，其和一些配体作为一类抗糖尿病新药已经在临床得到了日益广泛的应用。PPAR-γ具有较为复杂的生物学功能，在脂肪糖代谢、炎性反应等生理病理过程中均有参与。PPAR-γ配体根据来源不同可分为两大类：生理性配体和药理性配体。药理性配体包括比格列酮、罗格列酮等在内的噻唑烷二酮类药物。目前的研究认为，PPAR-γ配体分子进入细胞核后激活PPAR-γ而达到抗肿瘤的目的[8~11]。PPAR-Y配体可通过抑制增殖、诱导细胞凋亡及分化、抑制血管形成和降低肿瘤侵袭能力等不同机制发挥抗肿瘤作用，有望成为肿瘤 化疗的一个新途径[11-15]。最新研究表明，PPAR-γ在配体激活下能够对很多和癌形成相关的基因进行有效的调节，发挥着积极的抗肿瘤作用，如抗增殖、对细胞周期进程进行有效的抑制、对终端分化进行有效的诱导等，临床普遍认为其在癌症新药的预防和治疗中具有极为广阔的应用前景。

3.3 吡格列酮（PGZ）对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

吡格列酮属于一种PPAR-γ合成配体噻唑烷二酮类药物，在糖尿病的治疗中被当做胰岛素增敏剂使用。但是，大量医学研究均证实，PPAR-γ配体一方面能够促进患者血糖的极大降低，另一方面还能够通过对肿瘤细胞增殖的抑制及促进肿瘤细胞侵袭能力的降低等将其抗肿瘤的作用充分发挥出来。全反式维甲酸属于一种维生素A的合成衍生物，其促分化活性及抗增殖作用极为广泛，能够对多种肿瘤细胞的恶性生长进行有效的抑制，属于一种诱导分化剂，在临床极为常用。20世纪80年代以后，全反式维甲酸在白血病等的治疗中表现出极为显著的临床效果，在肿瘤的化疗及预防中发挥着至关重要的积极作用，目前临床已经对其进行了广泛而深入的研究。在胃癌方面，在对体外培养的SGC-7901细胞进行处理的过程中运用全反式维甲酸能够对细胞的增殖进行切实有效的抑制，并对癌细胞进行有效的诱导，使其转化为正常细胞。维甲酸的主要作用是由其核内受体RAR和RXR介导。多数医学研究显示，维甲酸可能通过对肿瘤细胞表型的改变及对基因表达的调控来实现始终增殖并诱导分化细胞水平的目的的。PPAR-γ受体结合其配体后，异源二聚体PPAR-γ/RXR在其结合RXR的情况下形成，作为转录因子能够和含有PPAR反应元件的下有目的基因进行有效的结合，从而将其转录调控作用充分发挥出来，并对目的基因表达进行有效的调节，因此一些医学学者在肿瘤细胞的研究中有机结合了PPAR-γ配体和RXR配体，发现联合使用二者能够促进其各自抗肿瘤效应的极大强化。

在胃癌SGC-7901细胞株中，我们联合应用了PPAR-γ配体吡格列酮及RXR配体全反式维甲酸，运用CCK-8法对不同浓度的吡格列酮、全反式维甲酸进行检测，同时对联合应用二者时增殖抑制胃癌SGC-7901细胞株的效应进行有效的检测，并运用RT-PCR方法对胃癌SGC-7901细胞株中PPAP-γ基因的表达和变化进行了检测，此外，MTT是常用的检测肿瘤细胞增殖活性效应的一种方法，该方法具有简便、快速、所需细胞数较少，人为误差小且较精确，没有放射污染等优点而广泛用于抗癌药物筛选。本研究采用MTT法观察PGZ对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用，与对照组比较，不同浓度PGZ作用12 h、24 h、48 h、72 h后癌细胞SGC-7901吸光度均表现为下降的趋势，不同浓度的PGZ （0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 mol/L）经不同的作用时间后，胃癌细胞SGC-7901吸光度与 对照组比较均有显著性差异（P<0.05），表明PGZ对胃癌细胞 SGC-7901具有生长抑制作用，并且呈剂量和时间依赖关系。除0.01mol/LPGZ对胃癌细胞 SGC-7901增殖没有明显的抑制作用（P>0.05），其它各剂量组对胃癌细胞SGC-07901增殖有明显的抑制作用，与对照组比较均有显著性差异（P<0.05），表明PGZ对胃癌细胞SGC-7901 有较强的体外细胞毒性作用，可以明显的抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，且存在剂量-时间的关系，但有关其确切的机制还有待于进一步深入研究。

综上所述，PGZ可以明显的抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，且存在剂量-时间的关系。

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（收稿日期：2013-11-28）

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（收稿日期：2013-11-28）