miR-483与结直肠癌关系的研究*

刘 媛 蒋菁蕊 吴少亘 曹望森 于成功 崔恒宓,3&

南京大学医学院附属鼓楼医院消化科1(210008) 南京大学医学院江苏省分子医学重点实验室2扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所3

微RNA(microRNAs, miRNAs)是一类长度一般为17～25个核苷酸的单链非编码小RNA分子，可与相应靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制，从而对基因表达进行转录后调控[1]。研究证实miRNAs在多种恶性肿瘤中呈现表达模式改变，在肿瘤形成过程中参与调节细胞增殖和凋亡，起癌基因或抑癌基因样作用[2]。因此，miRNAs表达谱有可能成为有效的肿瘤诊断分子标记物。近年研究发现胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)基因的第7号内含子中存在miR-483，但其功能迄今仍未能确定。IGF2基因已被证实在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤患者中呈高表达，并与肿瘤进展、转移和预后不良相关；IGF2印记丢失(loss of imprinting, LOI)与结直肠癌的发生风险有密切联系[3-5]。本研究以real-time PCR检测miR-483-3p、miR-483-5p在结直肠癌中的表达情况并分析其诊断性能，为结直肠癌诊断和治疗靶点的探索提供实验依据。

材料与方法

一、标本来源

收集2012年11月～2013年5月南京大学医学院附属鼓楼医院75例住院结直肠癌患者的癌组织和相应癌旁非癌组织(距癌灶边缘>5 cm)样本。75例患者中男40例，女35例，年龄34～87岁，平均(65.1±12.9)岁。入组患者均未接受过放疗或化疗，经组织病理学检查确诊，临床病理资料(性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度、TNM分期等)完整，TNM分期根据2009年UICC/AJCC结直肠癌TNM分期(第七版)标准。组织标本获取后立即液氮速冻，-80 ℃冰箱长期保存。所有标本采集均取得患者知情同意。

二、主要试剂和仪器

RNAlater®-ICE冰冻组织储存液、TRIzol®试剂、Applied Biosystems®TaqMan®MicroRNA逆转录试剂盒、TaqMan®Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan®MicroRNA Assay、Applied Biosystems®7300 Real-Time PCR System(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.)。

三、方法

1. 组织总RNA提取：取50～100 mg组织，加入10倍体积的RNAlater®-ICE，充分混合后-20 ℃冰箱过夜(至少16 h)，使组织充分浸入。参照TRIzol®试剂说明书提取组织总RNA，紫外分光光度法测定RNA浓度和A260/A280比值，-80 ℃冰箱保存。

2. Real-time PCR：以500 ng RNA为模板行逆转录反应，反应体系7.5 μL，包括10×RT缓冲液0.75 μL、RNA酶抑制剂0.095 μL、dNTPs(含 dTTP)0.075 μL、MultiScribeTMMuLV 0.5 μL和miRNA引物1.5 μL，余以ddH2O补足。反应参数：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR反应体系10 μL，包括DEPC处理的ddH2O 2 μL、TaqMan®Universal Master Mix Ⅱ(2×) 5 μL、TaqMan®MicroRNA Assay(20×) 0.5 μL和1∶3稀释的逆转录产物2.5 μL。反应参数：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。每一例样本设置3个复孔。以2-△△CT法计算目的miRNAs相对表达量。

四、统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，GraphPad Prism 5软件作图。正态性检验显示结直肠癌组织和癌旁组织中的miR-483-3p、miR-483-5p相对表达量不服从正态分布，以M(Q1,Q3)表示，两组间比较采用配对样本Wilcoxon符号秩和检验，癌组织中两者间相关性的分析采用Spearman相关系数，两者表达与结直肠癌临床病理特征关系的分析采用Kruskal-Wallis检验。以受试者操作特征(ROC)曲线分析miR-483-3p、miR-483-5p对结直肠癌的诊断性能，选取最佳截点判断诊断敏感性和特异性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、结直肠癌组织和癌旁组织miR-483-3p、miR-483-5p表达

Real-time PCR检测结果显示，结直肠癌组织中的miR-483-3p、miR-483-5p相对表达量均明显高于相应癌旁非癌组织，组间差异有统计学意义(P<0.000 1)(见图1、图2)。

二、结直肠癌组织中miR-483-3p与miR-483-5p表达的相关性

图1 miR-483-3p在结直肠癌组织和相应癌旁非癌组织中的表达

图2 miR-483-5p在结直肠癌组织和相应癌旁非癌组织中的表达

Spearman相关系数分析显示，结直肠癌组织中的miR-483-3p与miR-483-5p表达量呈显著正相关(rs=0.554 5,P<0.000 1)(见图3)。

图3 结直肠癌组织中miR-483-3p与miR-483-5p表达的相关性

三、miR-483-3p、miR-483-5p诊断性能分析

ROC曲线分析显示，miR-483-3p诊断结直肠癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.752 0(95% CI: 0.674 4～0.829 6)，最佳截点为9.22，其诊断敏感性和特异性分别为78.67%和62.67%(见图4)；miR-483-5p诊断结直肠癌的AUC为0.713 4(95% CI: 0.631 9～0.795 0)，最佳截点为11.61，其诊断敏感性和特异性分别为50.67%和85.33%(见图5)。如两者联合检测(并联试验)，诊断敏感性可提高至89.48%，特异性为53.48%。

图4 miR-483-3p诊断结直肠癌的ROC曲线

图5 miR-483-5p诊断结直肠癌的ROC曲线

四、结直肠癌组织中miR-483-3p、miR-483-5p表达与肿瘤临床病理特征的关系

结直肠癌组织中miR-483-3p、miR-483-5p表达与肿瘤临床病理特征之间关系的分析见表1，两者表达与患者的性别、年龄以及肿瘤大小、部位、分化程度和TNM分期均无相关性(P>0.05)。

讨 论

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，病死例数在全球男、女性肿瘤死因中分居第四和第三位[6]，而早期诊断和早期治疗可明显改善患者的预后。目前结直肠癌的早期筛查或检查手段主要有粪隐血试验(FOBT)、粪便DNA检测、结肠镜检查、钡灌肠检查、CT结肠三维成像等，这些方法虽能检出一些早期结直肠癌，但存在敏感性低、患者顺应性差或检查费用高等不足之处[7]。目前研究发现IGF2基因在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，而LOI是该现象较为公认的发生机制，在肿瘤发生中起重要作用。研究证实结直肠癌患者癌组织、正常结肠黏膜和外周血细胞中均存在IGF2 LOI， 引起等位基因双表达，导致IGF2基因表达水平成倍增高； IGF2 LOI与结直肠癌的发生风险有密切联系[5]。

表1 结直肠癌组织中miR-483-3p、miR-483-5p表达与肿瘤临床病理特征的关系

随着对IGF2基因研究的不断深入，现已逐步揭示出其在多种恶性肿瘤以及一些生理过程中与多种miRNAs之间存在密切联系[8-12]，报道最多的即为miR-483。miR-483位于IGF2基因第7号内含子中，与宿主基因IGF2共表达，两者间存在相关性，但其具体功能尚未明确[11-12]。前期实验发现与mRNA相比，miRNA的检测具有敏感性高、稳定性好等优点，作为生物学标记物较mRNA更为可靠。因此，本研究拟通过检测miR-483在结直肠癌中的表达情况，探讨其作为结直肠癌分子标记物的可能性。

miRNAs前体的发夹结构被类似DICER的核酸内切酶剪切为成熟的3p和5p片段[13]，近年研究显示miRNAs的3p和5p片段在肿瘤细胞中具有不同甚至相反的作用[14-16]，如2012年Almeida等[16]报道miR-28-3p和miR-28-5p在结直肠癌细胞中有着不同的靶mRNA，对肿瘤细胞在体内外的增殖、迁移、侵袭等生物学行为具有不同影响。因此，本研究以real-time PCR分别检测了结直肠癌组织和癌旁非癌组织样本中的miR-483-3p和miR-483-5p表达，结果显示两者在结直肠癌组织中的相对表达量均显著高于相应癌旁非癌组织，且两者表达量呈显著正相关。ROC曲线分析显示，以9.22为诊断截点，miR-483-3p对结直肠癌有较高的诊断敏感性(78.67%)，而miR-483-5p诊断特异性相对较高(85.33%，诊断截点11.61)，两者联合检测(并联试验)可将诊断敏感性提高至89.48%。然而，本研究未发现miR-483-3p、miR-483-5p在结直肠癌组织中的表达与包括性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度和TNM分期在内的肿瘤临床病理特征之间存在相关性。上述发现表明miR-483-3p、miR-483-5p可能与结直肠癌的发生有关，有望成为结直肠癌诊断潜在的分子标记物，但并不能提示肿瘤进展及其临床分期，可能需要进一步探索其他特异性指标进行联合诊断。后续拟进一步通过体内外实验对miR-483-3p、miR-483-5p与结直肠癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期变化及其迁移、侵袭能力等的相关性进行研究，并对术后患者进行长期随访，以全面评估两者在结直肠癌中的临床应用价值，为结直肠癌的诊断和治疗提供新的手段和思路。

1 Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116 (2): 281-297.

2 Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J]. Dev Biol, 2007, 302 (1): 1-12.

3 Chen YW, Boyartchuk V, Lewis BC. Differential roles of insulin-like growth factor receptor- and insulin receptor-mediated signaling in the phenotypes of hepatocellular carcinoma cells[J]. Neoplasia, 2009, 11 (9): 835-845.

4 Zhao R, Berho M, Nogueras J, et al. Positive correlation of insulin-like growth factor-Ⅱ with proliferating cell index in patients with colorectal neoplasia[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005, 14 (7): 1819-1822.

5 Cui H. Loss of imprinting of IGF2 as an epigenetic marker for the risk of human cancer[J]. Dis Markers, 2007, 23 (1-2): 105-112.

6 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61 (2): 69-90.

7 Miller S, Steele S. Novel molecular screening approaches in colorectal cancer[J]. J Surg Oncol, 2012, 105 (5): 459-467.

8 Ohdaira H, Sekiguchi M, Miyata K, et al. MicroRNA-494 suppresses cell proliferation and induces senescence in A549 lung cancer cells[J]. Cell Prolif, 2012, 45 (1): 32-38.

9 Gebeshuber CA, Martinez J. miR-100 suppresses IGF2 and inhibits breast tumorigenesis by interfering with proliferation and survival signaling[J]. Oncogene, 2013, 32 (27): 3306-3310.

10 Ge Y, Sun Y, Chen J. IGF-Ⅱ is regulated by microRNA-125b in skeletal myogenesis[J]. J Cell Biol, 2011, 192 (1): 69-81.

11 Ma N, Li F, Li D, et al. Igf2-derived intronic miR-483 promotes mouse hepatocellular carcinoma cell proliferation[J]. Mol Cell Biochem, 2012, 361 (1-2): 337-343.

12 Ma N, Wang X, Qiao Y, et al. Coexpression of an intronic microRNA and its host gene reveals a potential role for miR-483-5p as an IGF2 partner[J]. Mol Cell Endocrinol, 2011, 333 (1): 96-101.

13 Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, et al. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature[D]. Nucleic Acids Res, 2006, 34 (Database issue): D140-D144.

14 Jiang L, Huang Q, Zhang S, et al. Hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125a-5p are downregulated in non-small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 318.

15 López JA, Alvarez-Salas LM. Differential effects of miR-34c-3p and miR-34c-5p on SiHa cells proliferation, apoptosis, migration and invasion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 409 (3): 513-519.

16 Almeida MI, Nicoloso MS, Zeng L, et al. Strand-specific miR-28-5p and miR-28-3p have distinct effects in colorectal cancer cells[J]. Gastroenterology, 2012, 142 (4): 886-896.e9.