抵抗素样分子-α在急性胰腺炎继发急性肺损伤中的表达和作用*

陈 英 陈 平 王唯一 孙蕴伟 章永平 袁耀宗

上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科(200025)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常见急腹症之一，可继发胰腺假性囊肿、胰腺坏死、感染等局部并发症，并可发展为伴持续性多器官损伤的全身性并发症。重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)病情凶险，进展迅速，死亡率高，多器官功能衰竭为SAP的主要死因，尤以并发急性肺损伤最为突出[1-2]。抵抗素样分子-α(resistin-like molecule-α, RELM-α)亦可称为FIZZ1(found in inflammatory zone 1)或低氧诱导有丝分裂因子(HIMF)，是一个富含半胱氨酸的分泌蛋白，含有117个氨基酸残基，29%的氨基酸序列与抵抗素相同，主要分布于肺泡上皮细胞、脂肪细胞、单核细胞、巨噬细胞等， 具有刺激血管平滑肌细胞增殖、抗细胞凋亡、收缩血管、促进血管生成等功能[3-4]。目前，RELM-α在AP继发急性肺损伤中的作用尚未完全明确。本研究通过检测实验性AP大鼠模型急性肺损伤时肺组织中RELM-α的表达变化，分析其表达与急性肺损伤程度和AP预后相关指标之间的关系，探讨其在AP继发急性肺损伤中的作用，旨在为该AP并发症的临床防治提供新思路。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠45只，体质量150～200 g，由上海交通大学医学院附属瑞金医院动物实验室提供。

牛磺胆酸钠、L-精氨酸(Sigma公司)；RIPA裂解液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒(Pierce公司)；兔抗鼠RELM-α多克隆抗体(Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(福州迈新生物技术开发有限公司)。

二、方法

1. 动物分组和模型建立：大鼠随机分为急性坏死性胰腺炎(ANP)组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组和正常对照组，每组15只。适应性饲养1周，术前禁食24 h、不禁水。ANP组大鼠以10%戊巴比妥钠麻醉，取正中切口入腹，以血管夹夹闭胆总管，24号套管针由十二指肠前壁穿刺入胰管，通过微量注射泵 以0.1 mL/min匀速注入3.5%牛磺胆酸钠(1 mL/kg)，1 min后胰腺出现出血、坏死样改变，去除血管夹，逐层关腹。AEP组大鼠分3次，每次间隔 1 h，腹腔内注射3 000 mg/kg 20% L-精氨酸溶液。正常对照组大鼠仅行开关腹手术。于造模16 h后处死大鼠，处死前暴露支气管，结扎右侧支气管，穿刺左侧支气管，以预冷PBS灌洗5次，回收灌洗液。分别留取血液、胰腺和肺组织标本，用于后续各项检测。

2. 胰腺、肺组织病理学观察：取胰腺和右下肺叶组织，4%多聚甲醛溶液固定48 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。参考Mikawa等[5]的研究方法，根据：①肺泡充血；②肺泡腔、间质红细胞渗出；③肺间质细胞间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚或透明膜形成四项指标对肺组织损伤行组织病理学评分。

3. 肺湿/干重系数测定：取适量肺组织称量湿重，置于72 ℃干燥箱内烘烤24 h后称量干重，以肺湿/干重系数反映肺组织含水量。肺湿/干重系数=(湿重-干重)/干重×100%。

4. 支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数：取支气管肺泡灌洗液，1 000×g离心10 min，弃上清液，细胞重悬于PBS，应用细胞计数板于光学显微镜下计数中性粒细胞和巨噬细胞总数。

5. 血清CRP、淀粉酶检测：血液标本3 000×g离心15 min，分离血清，送上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，采用Beckman X7型全自动生化分析仪检测血清CRP、淀粉酶水平。

6. 蛋白质印迹法测定肺组织RELM-α表达：取适量肺组织，RIPA裂解液溶解，抽提总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量。取20 μg蛋白样品，电泳分离并转移至PVDF膜，分别加入兔抗鼠RELM-α多克隆抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的IgG二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，ECL显影。Bio-Rad数码成像系统扫描图片，应用Quantity One软件，以GAPDH为内参照定量分析RELM-α灰度值。

7. 免疫组化法测定肺组织RELM-α表达：肺组织石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，修复抗原，滴加非免疫性羊血清，室温孵育15 min，加入兔抗鼠RELM-α多克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的IgG二抗(1∶500)，室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：RELM-α免疫染色阳性为细胞质和(或)细胞膜呈棕黄色。

三、统计学分析

结 果

一、胰腺、肺组织病理学表现

ANP组胰腺组织可见间质肿胀，炎性细胞浸润，微血管壁结构破坏，红细胞渗出，腺泡细胞和脂肪细胞坏死；AEP组胰腺组织可见小叶间充血水肿，炎性细胞浸润；正常对照组胰腺组织未见明显病理学改变(见图1)。

ANP组肺组织可见肺泡间质肿胀，肺泡壁破坏，炎性细胞浸润，微血管壁结构破坏，肺泡内出血；AEP组肺组织可见肺泡间质充血水肿，少量炎性细胞浸润；正常对照组肺组织未见明显病理学改变(见图2)。ANP组肺组织病理学评分较AEP组和正常对照组显著升高(P<0.05)，AEP组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

二、肺湿/干重系数和支气管肺泡灌洗液炎性细胞数量

ANP组肺湿/干重系数较AEP组和正常对照组显著升高(P<0.05)，AEP组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ANP组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞和巨噬细胞数量较AEP组和正常对照组显著升高(P<0.05)，AEP组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

三、血清CRP、淀粉酶水平

ANP组血清CRP和淀粉酶水平[(241±62) μg/mL；(2 926±952) μg/mL]较AEP组[(141±28) μg/mL；(1 544±230) μg/mL]和正常对照组[(128±25) μg/mL；(874±230) μg/mL]显著升高(P<0.05)；AEP组血清淀粉酶水平较正常对照组显著升高(P<0.05)，CRP水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

A：ANP组；B：AEP组；C：正常对照组

A：ANP组；B：AEP组；C：正常对照组

表1 各组大鼠肺组织病理学评分、肺湿/干重系数、支气管肺泡灌洗液炎性细胞数量比较

四、蛋白质印迹法检测肺组织RELM-α表达

蛋白质印迹法检测结果显示，ANP组肺组织RELM-α表达水平(0.32±0.05)较AEP组(0.20±0.06)和正常对照组(0.18±0.04)显著升高(P<0.05)，AEP组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

1 Da=0.9921 u

五、免疫组化法检测RELM-α表达

免疫组化染色结果显示，RELM-α在ANP组肺组织中呈高表达，在AEP组肺组织中呈中度表达，正常对照组呈低表达或不表达(见图4)。

六、相关性分析

Spearman等级相关系数分析显示，肺组织中的RELM-α表达水平与肺组织病理学评分、肺湿/干重系数、支气管肺泡灌洗液炎性细胞数量呈正相关(rs=0.762，P<0.01；rs=0.753，P<0.01；rs=0.795，P<0.01)， 提示RELM-α表达水平可反映急性肺损伤程度。

线性回归模型分析显示，肺组织中的RELM-α表达水平与血清淀粉酶、CRP水平呈正相关(R=0.764，P<0.01；R=0.429，P<0.05)，提示RELM-α可作为AP预后判断指标。

讨 论

AP继发急性肺损伤的发生率可达35%，病程中胰酶自身消化和单核巨噬细胞活化可激活中性粒细胞，释放促炎介质，并通过炎症介质网络使效应级联放大，诱导肺组织内炎性细胞积聚、活化，引起急性肺损伤[2]。明确相关促炎介质的变化对AP继发急性肺损伤的防治具有重要意义。目前关于RELM-α在肺组织中作用的研究较多。Teng等[4]的研究显示，RELM-α可促进肺血管收缩和肺动脉平滑肌细胞增殖，作用呈剂量依赖性，其缩血管效应强于内皮素和血管紧张素Ⅱ。Dong等[6]的研究指出，肺过敏性炎症时，支气管黏膜上皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞中的RELM-α表达显著升高，参与调节支气管敏感性，与气道高反应性的发生有关。Liu等[7]对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的研究发现，RELM-α可诱导肺成纤维细胞分化和细胞外基质沉积，促进间质增生、纤维化。Holcomb等[3]的研究指出，RELM-α能显著促进肺微小血管收缩，提高肺血管压力。此外，Munitz等[8]的研究显示，在RELM-α基因敲除的结肠炎小鼠模型中， 促炎介质白细胞介素(IL)-6释放减少，抗炎介质IL-10释放增加，相关机制与JNK活性降低有关。由此可见，RELM-α在血管调节、细胞增殖、免疫反应、炎症反应等方面均发挥一定作用，然而目前相关研究主要集中于过敏性哮喘、肺纤维化、缺氧性肺损伤等疾病，对AP继发急性肺损伤的研究较少。

A：ANP组；B：AEP组；C：正常对照组

本研究以胰管内注射牛磺胆酸钠建立大鼠ANP继发急性肺损伤模型，以腹腔内注射L-精氨酸制备的大鼠AEP模型和仅施行假手术的大鼠作为对照，采用蛋白质印迹法和免疫组化法检测肺组织中RELM-α的表达和定位，并结合胰腺、肺组织病理学检查、肺湿/干重系数、支气管肺泡灌洗液炎性细胞数量以及血清CRP、淀粉酶水平的检测结果，探讨RELM-α在AP继发急性肺损伤中的作用。结果显示ANP组大鼠肺组织RELM-α表达水平、胰腺和肺组织损伤程度、肺湿/干重系数、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞和巨噬细胞数量、血清CRP和淀粉酶水平均较AEP组和正常对照组显著升高，进一步行相关性分析发现，肺组织RELM-α表达水平与急性肺损伤的严重程度呈正相关。上述结果提示RELM-α在AP病理过程中可能作为促炎介质，参与趋化和激活以中性粒细胞、巨噬细胞为主的炎性细胞，最终介导急性肺损伤发生。鉴于血清CRP、淀粉酶水平的变化在AP早期对判断疾病转归具有重要价值，本研究对上述指标与肺组织RELM-α表达水平的关系行线性回归模型分析，结果显示RELM-α表达水平与上述指标呈正相关，提示RELM-α高表达可能与ANP的预后有关。

综上所述，本研究结果显示，在AP病程中，RELM-α作为促炎细胞因子，可能参与趋化、激活以中性粒细胞、巨噬细胞为主的炎性细胞，最终介导急性肺损伤发生，但相关机制有待进一步研究。此外，肺组织RELM-α表达水平尚与AP预后相关，可作为监测AP预后的生物学标记物。

1 中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组，中华胰腺病杂志编辑委员会，中华消化杂志编辑委员会. 中国急性胰腺炎诊治指南(2013年，上海)[J]. 胃肠病学, 2013, 18 (7): 428-433.

2 Yuan Z, Meyerholz DK, Twait EC, et al. Systemic inflammation with multiorgan dysfunction is the cause of death in murine ligation-induced acute pancreatitis[J]. J Gastrointest Surg, 2011, 15 (10): 1670-1678.

3 Holcomb IN, Kabakoff RC, Chan B, et al. FIZZ1, a novel cysteine-rich secreted protein associated with pulmonary inflammation, defines a new gene family[J]. EMBO J, 2000, 19 (15): 4046-4055.

4 Teng X, Li D, Champion HC, et al. FIZZ1/RELMalpha, a novel hypoxia-induced mitogenic factor in lung with vasoconstrictive and angiogenic properties[J]. Circ Res, 2003, 92 (10): 1065-1067.

5 Mikawa K, Nishina K, Takao Y, et al. ONO-1714, a nitric oxide synthase inhibitor, attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits[J]. Anesth Analg, 2003, 97 (6): 1751-1755.

6 Dong L, Wang SJ, Camoretti-Mercado B, et al. FIZZ1 plays a crucial role in early stage airway remodeling of OVA-induced asthma[J]. J Asthma, 2008, 45 (8): 648-653.

7 Liu T, Jin H, Ullenbruch M, et al. Regulation of found in inflammatory zone 1 expression in bleomycin-induced lung fibrosis: role of IL-4/IL-13 and mediation via STAT-6[J]. J Immunol, 2004, 173 (5): 3425-3431.

8 Munitz A, Waddell A, Seidu L, et al. Resistin-like molecule alpha enhances myeloid cell activation and promotes colitis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2008, 122 (6): 1200-1207; e1.