藏药湿生扁蕾对人结肠癌细胞SW480增殖调控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表达的影响

1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省武威肿瘤医院，甘肃 武威 733000

藏药湿生扁蕾对人结肠癌细胞SW480增殖调控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表达的影响

王雅莉1*景明1，2*张艳霞1，2陈正君1高娜1赵慧巧1刘娟娟1苏永春3

1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省武威肿瘤医院，甘肃 武威 733000

目的探讨藏药湿生扁蕾对人结肠癌细胞SW480增殖调控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表达的影响。方法将SW480细胞接种于6孔培养板，24h后分别用不同浓度(0.25、0.50、1.00 mg/ml)的湿生扁蕾干预，继续培养24h，提取每组总RNA，以GAPDH基因为内参，采用RT-PCR法检测CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1的mRNA表达水平。结果PCNA、CyclinD1及CDK4的mRNA表达随湿生扁蕾浓度增加而减少，而p21kip1mRNA的表达随湿生扁蕾浓度增加而增加，并呈现明显的剂量依赖关系。结论藏药湿生扁蕾干预SW480细胞的增殖与其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA的表达和促进p21kip1的表达作用有关。

藏药湿生扁蕾；结肠癌SW480细胞；增殖调控因子

结直肠癌(ColoreetalCarcinom，CRC)是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一。在西方发达国家，其发病率高居恶性肿瘤的第2位。随着经济的发展和人均寿命的延长、生活方式和膳食结构的改变，我国结直肠癌的发病率也明显上升，每年新增病例己超过17万，尤其在天津、上海等大城市更为突出，男性高居第3位，女性仅次于乳腺癌而居第2位[1、2]。且其发病递增速度已达世界均数的两倍，我国已全面进入结直肠癌高发地区行列。如何有效的预防和治疗CRC，成为医学界高度关注的重要课题之一。此病在临床治疗方面，虽然以手术、药物为基础的联合化疗、放疗等治疗手段为患者带来了希望。但治疗过程中常用的化疗药普遍存在价格高、毒副作用大的缺点。因此，寻找、研制高效、低毒的药物就成为目前CRC治疗中迫待解决的问题。

藏药湿生扁蕾(GentianopsispaludosaMa)为藏族民间常用草药，为1年生草本，分布于青海海北、黄南、玉树等地区。具有消热、解毒和利湿消黄等功效[3]。近年来倍受关注。目前，有关其化学成分及临床应用已经成为研究重点，且多集中在其有效成分的分离、提取、药理作用等方面。由于其重要的药用价值，开发利用有着广阔的市场前景。湿生扁蕾现已在甘肃、青海作为重要藏药进行深度开发[4]。

前期研究发现，藏药湿生扁蕾的提取物可抑制人结肠癌细胞SW480的增殖，并诱导其凋亡。本研究观察了湿生扁蕾对SW480细胞增殖调控因子CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1表达的影响，探讨藏药湿生扁蕾干预SW480细胞增殖的分子机制，为结肠癌的治疗和新药开发开拓思路。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料①药物：藏药湿生扁蕾提取物(GTP，由甘肃中医学院科研实验中心提供)，规格10g原药材/1g提取物浸膏；②细胞：结肠癌SW480细胞株)，购自齐氏生物科技有限公司；③主要试剂：DMEM培养基(Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)， PBS(磷酸盐缓冲液，Hyclone公司)，二甲亚砜(DMSO，Gibco公司)，RT试剂盒(Promega公司)，Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，PCR试剂盒(Promega公司)，Taq聚合酶(TaKaRa公司)，PCR引物(上海英俊生物有限公司)；④主要仪器：超净工作台(苏州净化设备公司)，二氧化碳培养箱、5417R高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，9600型PCR仪(美国PE公司)，Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统、APC 300型电泳仪和水平式电泳槽(美国Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白核酸分析仪(美国Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 SW480细胞的培养 采用常规培养SW480细胞，培养液为含有10%小牛血清及青、链霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中培养，细胞单层贴壁生长至 80%左右融合时，以0.25%胰蛋白酶/EDTA消化后传代培养。

1.2.2 SW480细胞分组 处于对数生长期的细胞分成以下4组：空白对照组(加等体积的PBS)、湿生扁蕾低剂量组(0.25mg/ml)、湿生扁蕾中剂量组(0.5mg/ml)和湿生扁蕾高剂量组(1.0mg/ml)。

1.2.3 RT-PCR检测CyclinD1、CDK4、PCNA及p21的mRNA的表达水平 SW480细胞经胰酶消化后，接种于6孔培养板，细胞数约为2×105个/孔，24h后分别以不同浓度的湿生扁蕾干预，培养24h后，提取每组总RNA。

1.2.3.1 细胞总RNA的提取 按照Trizol试剂盒操作说明方法进行，随后取2μgRNA按照逆转录反应试剂盒要求配制反应体系进行反转录，反转录后产物置于-20℃保存，用于PCR扩增。

1.2.3.2 目的基因PCR扩增 在NCBI上查目的基因全序列，利用Premier5.0软件设计引物序列。CyclinD1：F:5′-TGG ATG CTG GAG GTC TGC GAG GAA -3′，R:5′-GGC TTC GAT CTG CTC CTG GCA GGC-3′；CDK4：F:5′-CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGC-3′，R:5′-AAC TGG CGC ATC AGA TCC TAG-3′；PCNA：F:5′-GCT GAC ATG GGA CAC TTA-3′，R:5′-CTC AGG TAC AAA CTT GGT G-3′；p21kip1：F:5′-GCG ACT GTG ATG CGC TAA TGG-3′，R:5′-TAG AAA TCT GTC ATG CTG GTC TGC-3′；GAPDH：F:5′- CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3′，R:5′- AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3′。取cDNA 1.0?l，加10×Taq Buffer 2.0?l，25 mM Mg2+1.2μl，10 mM dNTP0.4μl，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq酶0.6μl，DEPC水14.0μl配成20μl的总反应体积。在95℃预变性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35个循环，72℃10min。扩增产物 4℃保存，用于琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.3 PCR产物表达 取PCR扩增产物10μl，加2μl的loading buffer(6×)充分混匀后，加到1.5%琼脂糖凝胶上样孔中，通电，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿时停止电泳。

2 结果

SW480细胞经不同浓度湿生扁蕾提取物作用24 h后，CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表达随药物浓度增加而减少，而p21kip1m RNA表达随药物浓度增加而增多，并呈现明显的剂量依赖关系。见图1。

图1 湿生扁蕾对SW480细胞Cyclin D1、CDK4、PCNA和p21kip1的mRNA表达的电泳图(内参GAPDH)

3 讨论

适度的细胞增殖和凋亡是维持细胞群体数量稳定的重要条件，其调控错综复杂，受到细胞内、外多种因素和环节的影响，其中任何一个环节发生障碍，都可导致疾病的发生。肿瘤的发生主要特点是细胞凋亡不足，增殖过度，细胞群体稳态被破坏，导致病变细胞异常增多，病变组织器官体积增大，功能异常[5]。

CDK是细胞周期运转的驱动力量之一，其激活依赖于与Cyclin的结合和其中某些氨基酸残基的磷酸化状态。当Cyclin浓度升高到阈值时，可作为调节亚基与催化亚基CDK结合形成复合物，驱动细胞周期的运行。当一些增殖信号(生长因子、丝裂原等)与细胞膜上的相应受体结合后，可启动细胞内的信号转导，促进CyclinD1的合成，CyclinD1与CDK4相结合后，使抑制蛋白(Rb)磷酸化而丧失抑制转录因子E2F的作用，游离的E2F激活DNA合成基因，促使细胞从G0进入G1期[6]。除了促进细胞进入细胞周期进行分裂外，研究还发现，CyclinD1可以结合组蛋白去乙酰基酶 P/CAF，亦可以结合转录因子TFⅡD[7]等，通过和这些转录因子的结合，起到促进细胞周期运行的作用，而起过度表达则可致细胞增殖失控而发生恶性化。

PCNA也是一种细胞周期相关蛋白，但它不与CDK相结合，而是作为DNA聚合酶的附属蛋白，促进DNA的延伸，在G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[8]。

p21kip1能特意抑制CDK蛋白的功能，对细胞有抑制作用，一旦细胞受到毒素或辐射损害，p21kip1可与CyclinD/CDK结合并抑制其活性，减少pRb蛋白磷酸化，引起G1期阻滞促进修复，调控细胞周期确保遗传物质精确的传递给下一代，以消除DNA损伤而引发肿瘤[9]。

实验结果表明，藏药湿生扁蕾作用结肠癌SW480细胞24 h后，与对照组比较， CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表达减少，p21kip1·mRNA的表达增多，并呈现明显的剂量依赖关系。说明湿生扁蕾引起结肠癌SW480细胞凋亡可能与其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表达和促进p21kip1·mRNA的表达有关，而通过湿生扁蕾对SW480细胞周期及增殖的调控可能有助于对结肠癌患者的病情治疗。

[1] 李连弟, 赵平, 孔灵芝. 中国部分市、县恶性肿瘤的发病与死亡(第三卷)[M]. 北京:人民卫生出版社, 2007. 250-251.

[2] 李宝国. 结肠癌诊治的回顾与展望. 齐齐哈尔医学院学报[J], 2010, 31(13):2124-2125.

[3] 景明, 罗永皎, 刘喜平,等. 藏药湿生扁蕾提取物的止泻作用及其急性毒性研究[J]. 中成药, 2011, 33 (6):1049-1050.

[4] 曹长年, 米琴, 赵宙兴,等. 藏药湿生扁蕾有效成分的研究[J]. 青海农林科技, 2004 (3):12.

[5] 王建枝, 殷莲华主编. 病理学生理学第8版, 北京:人民卫生出版社, 2013. 10:129-133.

[6] Coqueret O. Linking Cyclins to transcription control[J]. Gene, 2002, 299: 35-55.

[7] Adnane J, Shao Z, Robbins PD. Cyclin D1 associates with the TBP associated factor TAF( Ⅱ) 250 to regulate Sp1 mediated transcrip-tion. Oncogene, 1999, 18: 239-247.

[8] 李宏, 廉斌, 王建,等. Topo11、P170、GST-π、PCNA及E-Cadherin在乳腺癌组织中的表达及临床意义[J]. 宁夏医学杂志, 2013(1):12-15.

[9] 马建安, 焦昌安, 陈刚,等. 染色体9p21基因单核苷酸多态性与新疆维吾尔族人群冠心病的关系 [J]. 新疆医科大学学报, 2012(12):1638-1642.

国家自然科学基金项目(编号81360522)。

王雅莉(1975-)，女，副教授。研究方向：免疫与分子生物学。

景明(1963-)，男，教授，硕士研究生导师。研究方向：中藏药新制剂开发研究。

R29

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1007-8517(2014)03-0001-02

2013.12.16)