Biglycan及血管内皮生长因子对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响及机制

邢晓静 谷小虎 马天飞

(辽宁省肿瘤医院肿瘤防治办公室，*胃肠外科，辽宁沈阳 110042)

结肠癌是全球常见的恶性肿瘤。在欧美国家，结肠癌的致死率位居恶性肿瘤的第2位，结肠癌的发病率在我国呈现逐年上升趋势[1-2]。biglycan是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族(small leucine-rich proteoglycans，SLRPs)的成员，也是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的组成部分[3]。近年来的研究[4-7]表明，biglycan基因在多种肿瘤组织中高表达，例如肝癌、卵巢癌、牙源性腺样癌。我们的前期研究[6]表明，biglycan在结肠癌中高表达，且与结肠癌的低分化、淋巴结转移和远处转移正相关。淋巴结转移和血行转移是肿瘤的主要转移途径，新生血管的形成又是肿瘤血行转移的基础，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在多种血管生长因子中起中心调控作用。本研究在结肠癌细胞系HCT116中转染biglycan cDNA和VEGF siRNA，企图从迁移、侵袭方面探讨biglycan及VEGF对结肠癌细胞的影响及机制，以期为治疗结肠癌提供依据。

1 资料与方法

1.1 细胞株与试剂 结肠癌细胞系HCT116购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，VEGF siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自辽宁省沈阳万类生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，引物由生工生物(上海)有限公司合成，Matrigel胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养 将细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的低糖DMEM培养液中，在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度条件下培养。每2～3 d更换1次培养液，待细胞生长至80%～90%融合时进行传代。

1.3 实验分组和细胞转染 实验设置未转染对照组(mock组)、空载质粒和非特异性干扰片段转染组(vector+siRNA-NC组)、biglycan cDNA和非特异性干扰片段转染组(biglycan+siRNA-NC组)以及biglycan cDNA和VEGF siRNA共转染组(biglycan+siRNA-VEGF组)。本实验室前期已经成功构建biglycan稳定转染的HCT116细胞系。VEGF siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，反义链：5′-AAAGUAGUGCUUCACCACUUC-3′，正义链：5′-UCAUCACGAAGUGGUGAAGAA-3′，阴性对照由该公司配套提供。转染前24 h，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化并接种于6孔培养板，之后按Lipofectamine 2000说明书操作，将siRNA-NC及siRNA-VEGF片段按实验分组转染至对应细胞中，干扰片段转染量为160 pmol/孔。

1.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测biglycan、VEGF mRNA的表达 采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书将mRNA反转录为cDNA。以β-actin为内参照，进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应。biglycan的上、下游引物序列为：5′-GGTCTCCAGCACCTCTACGCC-3′，5′-AACACTCCCTTGGGCACCTT-3′，扩增片段长度203 bp；VEGF的上、下游引物序列为：5′-CCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACT-3′，5′-CTCGGTGATTTAGCAGCAAGA-3′，扩增片段长度105 bp；β-actin的上、下游引物序列为：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，扩增片段长度为156 bp。参照2×Taq PCR Master Mix试剂盒说明书，在反应管中加入cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，最后加入双蒸水(double distilled water，ddH2O)补足总体积至20 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，应用凝胶成像系统将图片扫描入电脑并采用GelPro4.0软件对电泳结果进行灰度分析。

1.5 划痕实验检测迁移能力 取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后接种于6孔板。待细胞完全贴壁后用200 μL灭菌枪头在6孔板底部单层细胞的中央划一道痕，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤细胞后在显微镜下摄影。加入细胞培养液后于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h，观察细胞生长情况并用显微镜摄影，用Image-Pro Plus软件分别测量处理前后细胞划痕边界的距离，计算迁移率。

1.6 Transwell实验检测侵袭能力 将Matrigel胶4 ℃过夜以解冻，用无血清培养基将Matrigel胶在冰上按1∶2稀释。将Transwell小室放入24孔板中，用50 μL预先稀释好的Matrigel胶包被小室膜，在37 ℃培养箱中放置2 h，使Matrigel胶凝固。各组细胞经0.25%胰酶消化后稀释至密度为5×104个/mL的细胞悬液。将处理后的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20% FBS的培养液800 μL，上室加入细胞悬液200 μL，使细胞数达1×104个/孔，置于培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，用PBS轻轻冲洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，在多聚甲醛中室温固定20 min，苏木素染液染色7 min，蒸馏水冲洗。在倒置显微镜下(200×)计数迁移至微孔膜下层的细胞。每个样本选取5个视野计数细胞个数，取均数。

1.7 蛋白质印迹(Western blotting)法检测SNAIL、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表达 转染后48 h收获细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度。取40 μg总蛋白，经10%分离胶、5%浓缩胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至聚偏氟乙烯膜；用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入含SNAIL、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9的一抗封闭液，置于4 ℃摇床，过夜；PBS洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；将膜与电化学发光液静置反应5 min，转入暗盒中，在暗室进行曝光。独立实验重复3次。

1.8 明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9活性 转染后48 h收获细胞，提取总蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度。加入非还原型电泳缓冲液后，用含有1%明胶底物的8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，用2.5% TritonX-100室温洗涤30 min，转移至底物消化缓冲液中，37 ℃过夜。固定2 h后，用考马斯亮蓝染色20 min，脱色直至出现清晰的条带，对电泳结果进行图像扫描分析。

2 结 果

2.1 biglycan、VEGF mRNA的表达 biglycan+siRNA-NC组和biglycan+siRNA-VEGF组biglycan mRNA的表达水平均显著高于mock组及vector+siRNA-NC组(P<0.05)；biglycan+siRNA-NC组VEGF mRNA的表达水平显著高于mock组和vector+siRNA-NC组(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF组VEGF mRNA的表达水平显著低于biglycan+siRNA-NC组(P<0.05)。见图1。

2.2 迁移能力的检测结果 与mock组及vector+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-NC组细胞明显从划痕边缘向划痕内迁移，细胞迁移能力显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF组与biglycan+siRNA-NC组比较，细胞迁移能力显著下降(P<0.05)。见图2～3。

2.3 侵袭能力的检测结果 与mock组及vector+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-NC组细胞侵袭能力显著提高(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF组与biglycan+siRNA-NC组比较，细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)。见图4～5。

2.4 Western blotting法检测结果 与mock组和vector+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-NC组MMP-2、MMP-9、vimentin、SNAIL蛋白的表达水平显著升高，E-cadherin蛋白的表达水平则显著降低(P<0.05)；与biglycan+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-VEGF组MMP-2、MMP-9、vimentin、SNAIL蛋白的表达水平显著降低，E-cadherin蛋白的表达水平则显著提高(P<0.05)。见图6～7。

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

A、B、C、D分别为mock组、vector+siRNA-NC组、biglycan+siRNA-NC组、biglycan+siRNA-VEGF组划痕后0 h结果；a、b、c、d分别为相应组划痕后培养24 h结果

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

A、B、C、D分别为mock组、vector+siRNA-NC组、biglycan+siRNA-NC组、biglycan+siRNA-VEGF组

2.5 明胶酶谱法的检测结果 与mock组及vector+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-NC组MMP-2及MMP-9的活性明显增加(P<0.05)；而与biglycan+siRNA-NC组比较，biglycan+siRNA-VEGF组MMP-2及MMP-9的活性显著下降(P<0.05)。见图8。

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

与mock组比较，aP<0.05；与vector+siRNA-NC组比较，bP<0.05；与biglycan+siRNA-NC组比较，cP<0.05

3 讨 论

结肠癌术后肿瘤复发和转移是结肠癌病死的主要原因之一[8]。肿瘤细胞从原发部位脱落，侵入到ECM，通过基底膜细胞间质中的一些黏附分子激活基底膜细胞，并促使其合成和分泌各种降解酶；肿瘤细胞在这些酶的协助下进入血管，在某些因子作用下运行并穿过血管壁渗到继发部位，形成转移灶[9]。

biglycan是一种重要的ECM组成成分，是SLRPs家族成员之一。biglycan通过与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胶原分子以及其他基质因子相结合，参与ECM的聚集、细胞迁移与细胞黏附[10]。研究[11-12]表明，biglycan与肿瘤的发生、发展有重要关系，已经成为多种肿瘤的标志物。biglycan在肿瘤的迁移、侵袭中也发挥重要作用。研究[13]显示，biglycan在肿瘤血管内皮中的表达水平高于正常组织，下调biglycan的表达可抑制细胞的迁移能力。研究[14]显示，过表达biglycan可提高胃癌细胞的血管侵袭能力，且biglycan高表达与淋巴结转移、肿瘤分期有关；biglycan高表达的患者肿瘤复发率高、生存期短。在本研究中，当过表达biglycan时，划痕实验和Transwell实验显示，结肠癌细胞HCT116的迁移和侵袭能力显著增强，与已有的研究[14]结果一致；当过表达biglycan的同时下调VEGF时，biglycan促进肿瘤迁移和侵袭的作用则受到抑制。

vimentin是间质细胞标志因子，它的过表达标志着上皮-间质转化的发生，即启动了肿瘤转移。E-cadherin是一类介导同种细胞互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维护正常细胞间的联结，是介导细胞间连接最重要的一类分子。SNAIL是E-cadherin的转录抑制子[15]。MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞从肿瘤组织脱离及进入转移部位的过程中发挥重要作用，它们共同参与降解ECM大分子[16]。本研究中，当biglycan过表达时，VEGF的表达水平显著提高，介导细胞间连接的E-cadherin表达水平降低，而具有降解ECM作用的MMP-2、MMP-9、vimentin以及E-cadherin的转录抑制子SNAIL的表达水平均显著提高，MMP-2和MMP-9的活性显著升高。以上结果说明，biglycan的过表达能促进VEGF的表达并能增强HCT116细胞的迁移和侵袭。当biglycan过表达的同时，又干扰下调VEGF的表达时，上述与细胞迁移、侵袭相关的因子的表达水平均发生逆向的变化，MMP-2和MMP-9的活性也显著降低；这说明，干扰VEGF的表达可抑制biglycan对HCT116细胞迁移、侵袭的促进作用。

综上所述，biglycan通过促进VEGF的表达来促进结肠癌细胞HCT116的迁移和侵袭，下调VEGF的表达可逆转biglycan对HCT116细胞迁移和侵袭的促进作用。

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