五指山猪与长白猪妊娠期65d猪胎儿肌纤维差异比较研究

曹 婷，施力光，张立岭，周汉林，荀文娟，侯冠彧*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737;2.海南大学 农学院，海南 海口 570228)

五指山猪与长白猪妊娠期65d猪胎儿肌纤维差异比较研究

曹 婷1，施力光1，张立岭2，周汉林1，荀文娟1，侯冠彧1*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737;2.海南大学 农学院，海南 海口 570228)

为寻找五指山猪与长白猪肌肉发育关键时期(妊娠期65d)肌纤维发育差异情况，采用石蜡切片、HE染色、Image-Pro Plus软件测量及SAS软件统计分析多种技术对两猪种骨骼肌肌纤维的表观组织学特征、数目和横截面积差异进行分析。结果表明，五指山猪和长白猪妊娠期65 d胎儿肌纤维组织学外观有明显差异；并且长白猪猪胎儿骨骼肌肌纤维数目和横截面积均显著高于五指山猪(P<0.05)。试验结果确定两猪种肌肉发育关键时期肌纤维发育差异，为日后深入研究影响肌肉发育的机制提供了参考。

五指山猪；长白猪；妊娠期65 d；骨骼肌; 肌纤维

五指山猪，又称老鼠猪、五脚猪，系脊椎动物门、哺乳纲、偶蹄目、猪科、猪属，主要产于海南省五指山地区。其体型矮小、细致紧凑，四肢短细，头耳尖小，胸窄背直，腹垂臀实，灵敏善动，身覆黑或棕色毛皮，是中国的著名小型猪种之一[1]。五指山猪与人类在生理、病理及解剖学上有很大的相似，所以是较好的科研模式动物。而且其具有遗传性稳定，抗逆性强，代谢率低，皮薄膘少，肉质好，氨基酸和脂肪酸丰富等优点[1-2]，是杂优猪的理想选育品种。中国的地方猪具有肉感细腻，味道鲜美，细嫩多汁等美誉，但是生长速度缓慢、饲养成本大等不足导致很多优良的地方猪种已经消失或濒临灭绝，五指山猪就是面临以上问题的猪种之一，曾在2000年被列入《国家级畜禽品种资源保护名录》，并被收录于《中国生物多样性国情研究》成为国家二类重点保护动物[1]。长白猪则原产于丹麦，具有生长速度快、屠宰率高、胴体瘦肉率高、屠体较长等优点，但是存在肉质欠佳、抗逆性差、对饲料要求高等缺点和不足[3]。随着社会生活水平的不断提高和进步，生长率和瘦肉率的提高成为猪的养殖和培育上的重点，但是在目的性的选育过程中难免会降低其肉品质的保证，所以越来越多的肉品质优化问题变得日益显著起来[4]。

肌肉的生长发育和肉品质性状的形成是优良猪种选育和肉品质改良的研究重点。猪胎儿时期肌纤维的形成和发育是影响其出生后肌肉发育好坏和肉品质高低的关键[5-6]。组成肌肉的主要成分是肌纤维，肌纤维的大小和数量直接影响出生后产肉量的多少，肌纤维的数目在胎儿期就已经决定，出生后肌纤维数目不变，只是肌纤维的体积增长[7-9]，不同的猪种在肌纤维的数目和横截面积上都有着一定的差异[8,10-11]，因此研究肌纤维的数目和大小在探索肌肉生长发育差异上起很大的作用。研究证实，中国地方猪种肌纤维数目一般比西方瘦肉猪少且肌纤维比较细[4,10]。然而导致以上差异的因素有多种，如：遗传、环境、性别、信号通路都有密切的联系[8,12]。

本研究基于五指山猪生长缓慢、体型矮小但肉品质好等特点，与生长速度快、瘦肉率高、但抗逆性差、肉质欠佳并对饲料要求偏高的商用西方长白猪做实验对比，对其肌肉发育关键时期的胎儿肌纤维组织学进行分析。探索其肌肉发育关键时期(妊娠期65 d)肌纤维发育的差异与出生后产肉性能和肉品质的关联性，为肉品质的改良和优良种猪的选育提供可靠的试验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

由中国热带农业科学院品种资源研究所实验猪场饲养的妊娠期65 d的五指山猪和长白猪母猪各2头，快速处死，将胎盘取出，各猪种随机选取16头胎儿，采集其背部骨骼肌组织，放入4%多聚甲醛固定液中备用。

1.2 主要试剂和仪器材料

磷酸缓冲液-PBS、4%多聚甲醛固定液、酸醇、斯科特自来水、醇溶伊红、中性树脂、苏木精、乙醇、二甲苯等(自配或购于试剂公司)。LS-2055A轮转式切片机及烘片机(沈阳龙首电子仪器有限公司)，DHG-9246A烘箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 冲洗、固定 取新鲜组织，用磷酸缓冲液清洗，锋利刀片修成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小块，自制纱布包包好分别放入4%多聚甲醛固定24 h。

1.3.2 浸洗、脱水和透明 用磷酸缓冲液充分浸洗替换出固定液，依次移入50%、70%、80%、95%、95%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、乙醇/二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 h至组织块透明。

1.3.3 浸蜡、包埋、修蜡块 在60 ℃烘箱中浸蜡3～4 h，用充分熬制和排气泡完全的蜡液和自制包埋用纸盒进行包埋，冷却，用锋利刀片修成适当大小的梯形。

1.3.4 切片、展片、烤片 切片厚度保持在4～5 μm，在40 ℃温水中充分展片，轻捞至载玻片上40 ℃烘片机上烘干，在60 ℃烘箱内烘烤2～3 h(使切片紧密粘合，防止脱片)。

1.3.5 染色 二甲苯Ⅰ 15′→二甲苯Ⅱ 15′→无水乙醇Ⅰ 2′→无水乙醇Ⅱ 2′→95%乙醇 2′→85%乙醇 2′→70%乙醇 2′→50%乙醇 2′→蒸馏水 1′→苏木精 11′→蒸馏水 2′ →盐酸酒精(酸醇，自配)70〞→斯科特自来水(自配)15′→50%乙醇 3′→75%乙醇 3′→90%乙醇 3′→95%乙醇 3′→醇溶伊红7′30〞→95%乙醇 3′→95%乙醇 3′→95%乙醇 3′→无水乙醇Ⅰ 5′→无水乙醇Ⅱ 5′→二甲苯Ⅰ 8′→二甲苯Ⅱ 8′→封片→观察、摄取图像。

1.4 数据处理

通过Image-Pro Plus软件中的Measure→Measurements将HE染色图片进行肌纤维计数和表面积测量。SAS软件对得到的数据进行统计分析其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 两猪种65 d胎儿肌纤维表观差异

结果显示：经过石蜡切片HE染色的五指山猪和长白猪胎儿肌纤维在表观观察上有明显差异：五指山猪胎儿肌纤维之间界限模糊不清且肌纤维边缘不圆整，不易区分肌纤维数目和大小；而长白猪胎儿肌纤维之间界限清晰且肌纤维边缘圆整，能方便分出和辨别肌纤维数目和大小；五指山猪胎儿骨骼肌纤维细胞核分布位置主要集中在肌纤维周缘，而长白猪胎儿骨骼肌纤维细胞核主要分布在肌纤维中部。这些差异的出现都有可能是导致两猪种出生后产肉性能和肉品质差异的关键因素。结果见图1。

图1 五指山猪与长白猪妊娠65 d胎儿骨骼肌组织HE染色结果(×200)Fig.1 HE staining in skeletal muscle of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days(×200)

2.2 两猪种65 d胎儿肌纤维数目和横截面积差异

五指山猪与长白猪65d胎儿背肌纤维的数目及面积结果见表1。由表1可知，五指山猪65 d胎儿背部肌纤维数目显著少于长白猪65 d胎儿背部肌纤维数目(P<0.05)；长白猪65 d胎儿肌纤维横截面积显著大于五指山猪65 d胎儿骨骼肌肌纤维横截面积(P<0.05)。这些差异为进一步深入探讨肌肉发育机制奠定了基础。

表1 五指山猪与长白猪65 d胎儿背期肌纤维的数目和面积Table 1 Number and cross sectional area of Myofiber of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days

注：同列肩标小写字母不同表示显著差异(P<0.05)。

Notes: Different superscripts in the same column indicates the significant difference (P<0.05).

3 讨 论

肌肉的生长和肉品质性状的形成是一个漫长而又复杂的分子遗传生物学过程，影响肌肉发育和肉品质形成的因素有很多。本试验以外观、表型差异显著的中国地方小型猪的代表-五指山猪，和西方瘦肉型猪的代表-长白猪作为研究对象，对肌肉发育关键时期肌纤维的差异进行研究分析。为实现五指山猪的实验动物化、优良猪种的选育、肉品质的优化提升以及日后深入探索打下有力的理论基础，具有重要的经济意义和社会意义。

肌纤维的数目、大小和骨骼肌中肌细胞的数量直接决定骨骼肌的发育情况和机体的产肉量，肌纤维发育的差异对肌肉发育和肉品质的不同起着重要的决定作用[5,13-15]。肌纤维的发育过程从胚胎期开始，可概括为：多能胚胎干细胞→中胚层细胞→单核成肌细胞→肌纤维 (肌管融合肌细胞)，出生后肌纤维数目不会在改变，但肌纤维的体积会增大[16-17]，因此研究胎儿期肌纤维数量和大小的差异来探讨肌肉发育差异和肉质性状的不同具有很重要的研究意义。肌纤维的数目对日后肌肉发育的调控作用起着至关重要的作[18]。经研究得出，猪的肌纤维形成的主要过程是在妊娠期14 d到100 d，且有两个生长波，分别是30 d到60 d的第一个生长波和54 d到90 d的第二个生长波[9,18]，因此为了探索猪胎儿骨骼肌形成和猪种间生长差异机理，科研人员已经把注重点转移到关键发育时期研究其差异机制。

本研究选择五指山猪和长白猪妊娠期第二生长波范围内的65 d猪胎儿背部骨骼肌进行切片表观观察，并利用Image-Pro Express 6.0、SAS等软件对肌纤维进行数量和横截面积的测量、计算和比较。通过观察，可以看到五指山猪和长白猪妊娠期65 d猪胎儿骨骼肌肌纤维在表观观察上存在明显差异，五指山妊娠期65 d猪胎儿骨骼肌肌纤维之间界限模糊不清，且肌纤维边缘不圆整，不易辨别肌纤维数目和大小；而妊娠期65 d长白猪胎儿骨骼肌肌纤维却相反，其肌纤维之间界限清晰且肌纤维边缘圆整，易分辨肌纤维数目和大小。此外，细胞核的分布也有明显差异。与此同时，这两种猪胎儿骨骼肌纤维在数目和横截面积的大小上也有显著差异即：五指山猪65 d胎儿背部肌纤维数目显著少于长白猪65 d胎儿背部肌纤维数目；长白猪65 d胎儿背部肌纤维横截面积显著大于五指山猪65 d胎儿骨骼肌肌纤维横截面积。并且都具有统计学意义(P<0.05)。这一结果与多个相关研究发现西方的瘦肉型猪的肌纤维数比中国的地方猪的要多，且肌纤维粗这一结果一致[4,10]，在一定程度上证实了中国地方猪与西方瘦肉型猪在肌肉发育上存在的普遍差异点，为日后研究猪种改良和肉品质提升提供研究依据点。

本试验没有对不同猪种间其他胎儿阶段的肌纤维特征作对比，因此不能断定该阶段(妊娠期65 d)是否为不同猪种间肌肉发育差异最大的时间点。但是研究结果表明在妊娠期65 d的五指山猪和长白猪猪胎儿肌纤维组织无论在表观上还是分布、大小和数目上都有显著差异(P<0.05)。这一结果足以为日后分析不同猪种间肌肉发育差异和肉品质差异的作用机制和控制因素研究提供重要实验基础和分析依据。

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ResearchontheSignificantDifferenceoftheMyofiberofWuzhishanandLandracePigin65dFetalPeriod

CAO Ting1,SHI Li-guang1,ZHANG Li-ling2,ZHOU Han-lin1,XUN Wen-juan1,HOU Guan-yu1*
(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina,MinistryofAgriculture,China,HainanDanzhou571737;2.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,570228)

With the back skeletal muscle of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days as the experimental materials,HE staining,Image-Pro Plus,SAS technology,et al.were applied to analyze the significant difference of the myofiber at the critical period in muscle development (in fetal period at 65 days).The results showed that the number and the cross sectional area of Myofiber of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days revealed significant difference on the observation in appearance,and the Landrace pig was with higher number and the bigger cross sectional area of Myofiber than that of Wuzhishan pig (P<0.05).

Wuzhishan pig;Landrace pig;fetal period at 65 days;skeletal muscle;myofiber

2013-12-06，

2014-01-08

中国热带农业科学院中央及公益性科研院所基本科研业务费专项(1630032013020)；海南省自然科学基金(311071)；家养动物种质资源平台项目资助

曹 婷(1987-)，女，吉林人，硕士，从事家畜遗传资源研究。E-mail:jilincaoting@126.com.

*[通讯作者]侯冠彧(1975-)，男，内蒙通辽人，博士，副研究员，从事家畜遗传资源研究。E-mail: guanyuhou@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0037-04