三七总皂苷对大鼠心肌梗死后血管新生及微小RNA-21表达的影响

樊清波，李小威，简立国，秦秉玉

1)河南省人民医院重症医学科 郑州 450003 2)郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014

三七总皂苷对大鼠心肌梗死后血管新生及微小RNA-21表达的影响

樊清波1)，李小威2)#，简立国2)，秦秉玉1)

1)河南省人民医院重症医学科 郑州 450003 2)郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014

#通讯作者，男，1985年12月生，硕士，住院医师，研究方向：冠心病的基础与临床，E-mail:15938779015@163.com

三七总皂苷；心肌梗死；大鼠；血管内皮生长因子；微小RNA-21

目的：观察三七总皂苷对大鼠心肌梗死后血管新生和VEGF、微小RNA-21(miRNA-21)表达的影响。方法108只健康Wistar大鼠结扎左冠状动脉建立急性心肌梗死模型后分为心肌梗死对照组、三七总皂苷低剂量治疗组和三七总皂苷高剂量治疗组，心肌梗死对照组和三七总皂苷治疗组分别于术后即刻及术后每天腹腔注射生理盐水和三七总皂苷(100和400 mg/kg)，术后3、7、14、21 d分别处死9只大鼠，进行心肌梗死面积百分比测定，免疫组化法测定梗死周边区微血管密度和VEGF蛋白相对表达量，RT-PCR法检测miRNA-21、VEGF mRNA相对表达量。结果3组3、7、14及21 d梗死周边区微血管密度、心肌梗死面积百分比、VEGF蛋白相对表达量、VEGF和miRNA-21 mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义(F微血管密度=35.163、42.906、49.510、54.245，P均<0.001；F梗死面积百分比=59.358、68.241、66.350、58.667，P均<0.001；FVEGF 蛋白=145.576、164.024、179.349、186.362，P均<0.001;FVEGF mRNA=253.542、268.958、315.313、347.914，P均<0.001;FmiRNA-21 mRNA=53.421、67.954、72.358、75.694，P均<0.001)。与心肌梗死对照组相比，三七总皂苷治疗组微血管密度、VEGF蛋白、VEGF和miRNA-21 mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)，心肌梗死面积百分比减少(P均<0.05)；不同剂量三七总皂苷治疗组上述各指标比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。各组梗死周边区miRNA-21、VEGF mRNA的相对表达量间均呈正相关(r心肌梗死对照组=0.609，P=0.036；r三七总皂苷低剂量治疗组=0.522，P=0.047；r三七总皂苷高剂量治疗组=0.581，P=0.042)。结论三七总皂苷有促进心肌梗死后VEGF和miRNA-21表达、促进血管新生和缩小梗死面积的作用。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是临床常见的急危重疾病。近年来AMI后再血管化治疗取得了令人瞩目的成就，然而合并冠状动脉弥漫性病变、多次手术及远端过细的患者往往失去了再血管化治疗的机会，因此治疗性血管新生成为这些患者新的治疗方式。三七总皂苷是三七的主要成分之一。研究证明，三七总皂苷可改善心肌缺血再灌注损伤[1]，增加脑梗死后侧支循环,改善缺血部位血流供应[2]，因此推测三七总皂苷可促进心肌梗死后血管新生。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成过程中重要的调节因子；微小RNA(miRNA)是真核细胞中参与转录后基因调控的非编码单链小分子RNA，其中miRNA-21参与新生血管的内膜形成[3]。该实验通过观察三七总皂苷对大鼠心肌梗死后血管新生和VEGF、miRNA-21表达的影响，探讨其促血管新生的分子机制。

1 材料与方法

1.1药物、主要试剂及仪器三七总皂苷粉(昆明圣火制药有限责任公司)，SP免疫组化试剂盒及抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，大鼠VEGF引物序列、内参β-actin引物序列(武汉博士德生物工程有限责任公司)，Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，miRNA-21、内参U6引物、ALL-in-One miRNA PCR检测试剂盒(GeneCoporia公司)，小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备公司)，显微镜、彩色病理图像分析系统(日本Olympus公司)，石蜡切片机(德国蔡司公司)，MFLLab200心功能记录仪。

1.2动物造模及分组健康雄性Wistar大鼠108只(河南省实验动物中心提供，合格证号：410116)，体重(200±20) g，(3.1±0.6)个月，采用随机数字表法分为心肌梗死对照组、心肌梗死后三七总皂苷低剂量治疗组和三七总皂苷高剂量治疗组。参考文献[4]方法，体积分数10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，常规背位固定，连接多导生理信号采集处理系统，经口气管插管，接小动物呼吸机。左前胸常规备皮、消毒，在左侧第3、4肋处横向切开皮肤，钝性分离肌层，沿第3肋或第4肋间隙打开胸腔，以开胸器扩大手术视野，切开心包，在动脉圆锥与左心耳下约1 mm处用线结扎左冠状动脉前降支，观察前壁心肌组织颜色由鲜红迅速变为暗红，随后逐渐变为白色，心电图监测Ⅰ和avL导联ST段较前上抬>0.2 mV 提示手术成功。心脏重置于胸腔，分层缝合胸壁。术后腹腔注射青霉素3 d抗感染，心肌梗死对照组及药物治疗组术后即刻及术后每天腹腔注射生理盐水和三七总皂苷(100和400 mg/kg)，术后3、7、14、21 d分别处死大鼠，每组9只，在乳头肌横切面处切取心肌组织，经中性甲醛溶液固定后，常规脱水、透明、石蜡包埋，切成4～5 μm厚组织切片。

1.3大鼠心肌梗死周边区心肌血管新生情况的免疫组化法观察将上述组织切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体进行免疫组化染色，计数梗死区微血管数目，免疫组化步骤按照说明书进行。微血管计数标准参考文献[5]，血管腔以及红细胞出现并不是计数必需结构，凡染成棕色的单个内皮细胞及内皮细胞丛均被看作一个微血管。具体方法为低倍镜下找到梗死周边区组织，切换为200倍镜后观察并计数微血管，每张切片观察5个视野，取均数。

1.4大鼠心肌组织梗死面积百分比测定各组处死大鼠后，中性甲醛溶液灌流固定后取出心脏，沿左室短轴横切，常规脱水、透明、包埋、切片、HE染色，光镜下观察，采用图像分析系统检测心肌梗死面积和左室心肌面积，梗死面积百分比=心肌梗死面积/左室心肌面积×100%。

1.5大鼠心肌梗死周边区VEGF蛋白的表达情况

将组织切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体进行免疫组化染色，以梗死周边区细胞内出现棕黄色颗粒为VEGF阳性，采用图像分析系统测定梗死周边区400倍视野下的光密度值，每张切片观察7个视野，取均数作为VEGF蛋白的相对表达量。

1.6大鼠心肌梗死周边区miRNA-21、VEGFmRNA的表达情况总RNA提取参照Trizol试剂盒说明书进行。每个样本取1 μg总RNA作为逆转录模板合成cDNA。VEGF引物序列：上游5’-AGAAGG AGGAGGGCAGAATCA-3’，下游5’-CAAATGCTTTCT CCGCTCTGA-3’，扩增片段大小326 bp；β-actin引物序列：上游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’，下游5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，扩增片段大小471 bp。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共40个循环；72 ℃ 10 min。1.6 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析系统测定吸光度值与β-actin的比值即代表VEGF mRNA的相对表达量。miRNA-21引物序列：上游5’-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’，下游5’-GACT GTGACGACTACCCCAA-3’，扩增片段大小75 bp；U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，扩增片段大小109 bp。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。产物经溶解度曲线单峰验证，记录每个反应管中的荧光信号达到所设定的阈值时所需要的循环数(Ct值)，ΔΔCt=(CtmiRNA-21-CtU6)治疗组-(CtmiRNA-21-CtU6)对照组，数据采用2-ΔΔCt法分析，计算miRNA-21与内参U6比值作为miRNA-21 mRNA的相对表达量。

1.7统计学处理应用SPSS 13.0进行分析。3组间心肌梗死周边区微血管密度、梗死面积百分比、VEGF蛋白、miRNA-21和VEGF mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；各组miRNA-21、VEGF mRNA相对表达量、微血管密度间的关系采用Pearson积差相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠心肌梗死周边区微血管密度比较三七总皂苷治疗组心肌梗死周边区微血管密度高于心肌梗死对照组，且三七总皂苷高剂量治疗组高于三七总皂苷低剂量治疗组，见图1、表1。

图1 各组大鼠术后3 d心肌梗死周边区微血管新生情况(SP，×200)

表1 各组大鼠心肌梗死周边区微血管密度比较(n=9) 个/视野

*：与心肌梗死对照组比较，P<0.05；△：与三七总皂苷低剂量治疗组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠心肌组织梗死面积百分比比较三七总皂苷治疗组心肌组织梗死面积百分比均低于心肌梗死对照组，且三七总皂苷低剂量治疗组高于三七总皂苷高剂量治疗组，见表2。

表2 各组大鼠心肌组织梗死面积百分比比较(n=9) %

*：与心肌梗死对照组比较，P<0.05；△：与三七总皂苷低剂量治疗组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠心肌梗死周边区VEGF蛋白相对表达量比较结果见表3。3组间VEGF蛋白相对表达量比较及组间两两比较，差异均有统计学意义。

表3 各组大鼠心肌梗死周边区VEGF蛋白相对表达量比较(n=9)

*：与心肌梗死对照组比较，P<0.05；△：与三七总皂苷低剂量治疗组比较，P<0.05。

2.4各组大鼠心肌梗死周边区miRNA-21、VEGFmRNA相对表达量比较结果见图2和表4、5。

图2 各组大鼠心肌梗死周边区VEGF mRNA表达检测结果

表4各组大鼠心肌梗死周边区VEGFmRNA的相对表达量比较(n=9)

组别3d7d14d21d心肌梗死对照组0．74±0．100．82±0．110．84±0．130．86±0．09三七总皂苷低剂量治疗组1．15±0．17∗1．29±0．23∗1．36±0．18∗1．41±0．15∗三七总皂苷高剂量治疗组1．32±0．24∗△1．69±0．28∗△1．77±0．14∗△1．89±0．31∗△F253．542268．958315．313347．914P<0．001<0．001<0．001<0．001

*：与心肌梗死对照组比较，P<0.05；△：与三七总皂苷低剂量治疗组比较，P<0.05。

表5 各组大鼠心肌梗死周边区miRNA-21 mRNA的相对表达量比较(n=9)

*：与心肌梗死对照组比较，P<0.05；△：与三七总皂苷低剂量治疗组比较，P<0.05。

2.5各组miRNA-21、VEGFmRNA相对表达量、微血管密度间相关性分析各组梗死周边区miRNA-21、VEGF mRNA相对表达量呈正相关(r心肌梗死对照组=0.609，P=0.036；r三七总皂苷低剂量治疗组=0.522，P=0.047；r三七总皂苷高剂量治疗组=0.581，P=0.042)。各组梗死周边区miRNA-21 mRNA相对表达量与微血管密度呈正相关(r心肌梗死对照组=0.514，P=0.041；r三七总皂苷低剂量治疗组=0.528，P=0.019；r三七总皂苷高剂量治疗组=0.625，P=0.014)。各组梗死周边区VEGF mRNA相对表达量与微血管密度呈正相关(r心肌梗死对照组=0.590，P=0.021；r三七总皂苷低剂量治疗组=0.564，P=0.008；r三七总皂苷高剂量治疗组=0.657，P=0.010)。

3 讨论

AMI是冠状动脉急性、持续缺血缺氧所引起的心肌坏死，经皮冠状动脉血管腔内成形术、冠状动脉支架植入术及冠状动脉旁路移植术等方法是临床治疗AMI常见且有效的方法，而对于直径<2 mm的血管，上述治疗方法无法获益。近年来，促进缺血区血管新生成为研究热点[6-8]。Sasaki等[9]研究发现使用生长因子类基因产物可刺激缺血心肌组织新生血管形成；Hattori等[10]发现自体骨髓干细胞移植可促进严重缺血心肌组织血管形成，药物治疗特别是中药制剂也可促进侧支循环形成[11]，实现缺血区自我搭桥。VEGF是血管内皮细胞特异性促有丝分裂原，是目前发现最特异的促进新生血管形成的生长因子，临床和基础实验[12-14]均证明VEGF可促进侧支循环的建立，改善心肌供血。miRNA可通过与靶mRNA结合，促进靶mRNA降解，对基因进行表达后转录调控，参与疾病的病理生理过程。研究发现，miRNA-21具有促进新生血管内膜形成[3]、缩小心肌梗死面积[15-17]、促进心脏肥大[18]及参与心肌纤维化形成等作用。

该研究结果表明，三七总皂苷治疗组心肌梗死周边区微血管密度高于心肌梗死对照组，且三七总皂苷高剂量治疗组高于三七总皂苷低剂量治疗组。梗死周边区VEGF蛋白的相对表达量同微血管密度呈正相关，三七总皂苷治疗组VEGF蛋白及mRNA的相对表达量均高于心肌梗死对照组，提示三七总皂苷可通过上调VEGF的表达进而促进梗死周边区新生血管形成。心肌梗死后VEGF表达增加虽然可促进梗死周边区新生血管形成，但同时也增加新生血管通透性，不利于功能血管形成，梗死周边区微血管密度增加提示存在其他因子参与新生血管形成。该研究中心肌梗死对照组梗死周边区miRNA-21 mRNA的相对表达量均低于三七总皂苷治疗组，且miRNA-21 mRNA的相对表达量与微血管密度呈正相关，提示miRNA-21可能参与了新生血管形成，三七总皂苷可上调miRNA-21的表达促进梗死周边区功能血管形成。

该研究中三七总皂苷治疗组心肌梗死面积百分比均低于心肌梗死对照组，而miRNA-21 mRNA的相对表达量高于心肌梗死对照组，提示三七总皂苷可通过上调miRNA-21的表达减少心肌梗死面积百分比，这与文献[15-17]结果一致。该实验结果显示miRNA-21与VEGF mRNA相对表达量呈正相关，可能的解释是VEGF mRNA是miRNA-21的靶mRNA或者miRNA-21通过调控其他靶mRNA进而影响VEGF mRNA表达，其具体机制尚有待进一步研究。尽管该实验证实了三七总皂苷有促进心肌梗死后VEGF和miRNA-21表达、促进梗死周边区血管新生和缩小梗死面积百分比的作用，然而其具体机制还有待进一步研究，以为临床应用提供理论依据。

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(2013-06-24 收稿 责任编辑 姜春霞)

Effects of panax notoginseng saponins on angiogenesis and miRNA-21 expression in rats with myocardial infarction

FANQingbo1),LIXiaowei2),JIANLiguo2)，QINBingyu1)

1)DepartmentofCriticalCareMedicine,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 2)DepartmentofCardiology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

panax notoginseng saponin; myocardial infarction; rat; vascular endothelial growth factor; miRNA-21

Aim: To explore the effects of panax notoginseng saponins(PNS)on angiogenesis and VEGF, miRNA-21 expressions in rats with myocardial infarction.Methods: The left coronary artery of 108 male Wistar rats was ligated to make the models of acute myocardial infarction.All rats were randomly divided into myocardial infarction control group,low PNS group(100 mg/kg)and high PNS group(400 mg/kg). The microvascular density in the infarct area， VEGF protein, miRNA-21 and VEGF mRNA were detected at 3,7,14,21 day after operation.Results: At 3, 7, 14 and 21 day,there were significant differences in microvascular density,infarct areas,the expressions of VEGF protein,VEGF and miRNA-21 mRNA among the three groups(Fmicrovascular density=35.163, 42.906, 49.510, 54.245，P<0.001;Finfarct areas=59.358, 68.241, 66.350, 58.667，P<0.001;FVEGF protein=145.576,164.024,179.349,186.362，P<0.001;FVEGF mRNA=253.542, 268.958, 315.313, 347.914，P<0.001;FmiRNA-21 mRNA=53.421, 67.954, 72.358, 75.694，P<0.001).The infarct areas decreased significantly in PNS groups while the other 3 indexes increased compared with myocardial infarction control group(P<0.05).There were also significant differences in the above indexes between low PNS group and high PNS group(P<0.05).The expressions of miRNA-21 and VEGF mRNA in infarct areas had positive correlation(rmyocardial infarction control group=0.609,P=0.036;Flow PNS group=0.522,P=0.047；Fhigh PNS group=0.581,P=0.042).Conclusion: PNS could increase VEGF and miRNA-21 expression, improve angiogenesis and decrease infarct area after myocardial infarction.

R542.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.014