吡格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC表达的影响*

杜芳宇，刘剑波

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

吡格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC表达的影响*

杜芳宇，刘剑波#

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

#通讯作者，男,1964年2月生,博士,教授,主任医师,研究方向：哮喘的发病机制和防治，E-mail:jbliuzz@yahoo.com.cn

A型γ-氨基丁酸受体α亚单位; MUC5AC; 吡格列酮; 哮喘；小鼠

目的：观察吡格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC表达的影响。方法30只成年BALB/C小鼠随机分为3组，每组10只。哮喘组和吡格列酮干预组以卵白蛋白(OVA)致敏、激发制作哮喘小鼠模型，吡格列酮干预组于每次激发前30 min雾化吸入吡格列酮5×10-5mol/L，对照组以生理盐水代替OVA处理。末次激发后24 h处死小鼠，取肺组织行HE染色观察气道病理学表现，采用免疫组化SP法、RT-RCR法检测肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表达。结果哮喘组小鼠气道黏膜下充血水肿，黏膜层增厚，支气管壁及血管壁周围有较多炎性细胞浸润；吡格列酮干预组上述表现较哮喘组减轻。哮喘组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表达水平均较对照组高，吡格列酮干预组较哮喘组降低，但仍高于对照组(P均<0.05)。结论吡格列酮可能通过下调GABAARα的表达在哮喘气道黏液过度分泌中起治疗作用。

炎症、重构及黏液高分泌是支气管哮喘的重要病理表现。吡格列酮是过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)激动剂。研究[1-2]显示PPARγ激动剂除可明显抑制促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的产生外，还可抑制哮喘模型小鼠肺嗜酸粒细胞及气道高反应性。A型γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)属受体门控离子受体超家族，α亚单位在GABAAR复合物的组装和功能中可能起主要作用。近来研究[3]发现GABA合成酶和GABAAR在气道上皮细胞表达,而且哮喘时表达增强,伴有黏液过度分泌。MUC5AC由气道杯状细胞分泌，反映了气道黏液分泌的情况。该实验旨在研究吡格列酮干预后哮喘模型小鼠肺组织GABAARα和MUC5AC表达水平的变化,探讨哮喘时气道黏液过度分泌的发生机制,并为哮喘的早期干预治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，盐酸吡格列酮(江苏恒瑞医药股份有限公司惠赠)，小鼠抗MUC5AC单克隆抗体、小鼠抗GABAARα单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，免疫组化试剂盒及DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Trizol试剂、RT-PCR 试剂盒(Transgene公司)，超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)，德国Lecia显微照像系统，PCR扩增仪(Eppendorf公司)，D-140图像记录分析系统(大连竞迈生物科技有限公司)。

1.2实验分组及处理6～8周龄清洁级BALB/C小鼠30只，体重18～22 g，购自河南省实验动物中心。按随机数字表法分为3组：对照组、哮喘组和吡格列酮干预组，每组10只。实验第1天和第8天，哮喘组及吡格列酮干预组小鼠腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液0.2 mL[含OVA 50 μg和Al(OH)35 mg]致敏,从实验第15天开始以20 g/L OVA雾化吸入30 min/d激发，连续7 d；吡格列酮干预组于OVA雾化吸入前30 min雾化吸入吡格列酮(5×10-5mol/L)；对照组以生理盐水代替OVA致敏、激发。末次激发后24 h，体积分数5%的水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，打开胸腔，结扎右肺门根部，生理盐水0.3 mL行左肺支气管肺泡灌洗，共3次，合并得支气管肺泡灌洗液(BALF)。取右肺组织浸入体积分数10%中性甲醛中固定，经脱水、包埋制成蜡块，切片后部分行HE染色，部分用于免疫组化检测。切取左肺叶迅速放入液氮中，速冻后转移至-80 ℃冰箱中用于RT-PCR检测。

1.3BALF细胞计数取150 μL BALF 细胞悬液与细胞计数液按11稀释混匀，显微镜下计数细胞总数，其余BALF 4 ℃、2 000 r/min离心10 min，沉淀物涂片，行瑞氏染色，每个标本计数200个细胞。

1.4肺组织病理学观察取肺组织切片，常规HE染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围炎性细胞浸润情况。

1.5肺组织GABAARα和MUC5AC蛋白的检测采用免疫组化SP法。切片经常规脱蜡水洗后，柠檬酸修复抗原，用体积分数3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，小鼠抗MUC5AC单克隆抗体、小鼠抗GABAARα单克隆抗体按150稀释。实验按试剂盒说明步骤操作。阳性部位呈棕褐色。采用图像积分光密度分析软件进行图像分析，取平均积分光密度值表示目的蛋白的表达水平。

1.6肺组织GABAARα和MUC5ACmRNA的检测采用RT-PCR法。GABAARα上游引物5’-CAAAGCTCGGATAGGAGAC-3’，下游引物5’-CACT GGTGGGTGGAATGAC-3’，扩增片段大小为167 bp。MUC5AC上游引物5’-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3’，下游引物5’-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3’，扩增片段大小为368 bp。GAPDH上游引物5’-ACG GCAAATTCAACGGCACA-3’，下游引物5’-AGGCG GCACGTCAGATCCAC-3’ ，扩增片段大小为589 bp。取约100 mg肺组织，研磨后加入Trizol 1 mL，参照说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA。以2 μL cDNA为模板行PCR。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(GABAARα及MUC5AC为56 ℃，GAPDH为58 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，以目的基因与内参条带灰度值之比作为目的基因的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 20.0处理数据。3组间BALF细胞总数、嗜酸粒细胞计数和肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白及mRNA表达的比较采用单因素方差分析，多组样本均数两两比较，方差齐者用LSD-t检验，方差不齐者用Dunnett’s T3 法检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠BALF细胞总数和嗜酸粒细胞计数比较见表1。

表1 3组BALF细胞总数和嗜酸粒细胞计数×109 L-1

*:与对照组比较，P<0.05；#:与吡格列酮干预组比较，P<0.05。

2.2 3组小鼠肺组织病理学表现HE染色见：对照组小鼠气道黏膜上皮正常，气道周围无明显炎性细胞浸润，肺泡壁结构完整；哮喘组小鼠气道黏膜上皮局部脱落，黏膜下充血水肿，黏膜层增厚，支气管壁及血管壁周围有较多炎性细胞浸润；吡格列酮干预组黏膜上皮相对完整，黏膜下充血水肿、气道壁增厚及炎性细胞浸润较哮喘组减轻。见图1。

2.3 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白的表达GABAARα蛋白主要表达于气道上皮，在基底部无表达，阳性表达产物定位于细胞膜；MUC5AC阳性染色仅见于支气管上皮细胞，表现为胞浆内可见棕褐色颗粒。哮喘组肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白表达强于吡格列酮干预组，且二者均高于对照组。见图1和表2。

图1 3组小鼠肺组织病理学表现及GABAARα和MUC5AC蛋白的表达

A：对照组；B：哮喘组；C：吡格列酮干预组；1：肺组织病理学表现(HE，×400)；2：肺组织中GABAARα蛋白的表达(SP，×400)；3：肺组织中MUC5AC蛋白的表达(SP，×400)。

表2 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白的表达

*:与对照组比较，P<0.05；#:与吡格列酮干预组比较，P<0.05。

2.4 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5ACmRNA的表达哮喘组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA的相对表达量均高于吡格列酮干预组，且二者都高于对照组。见图2和表3。

图2 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA的表达

表3 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5ACmRNA的表达

组别nGABAARαmRNAMUC5ACmRNA对照组100．33±0．080．50±0．52哮喘组100．88±0．14∗#0．93±0．17∗#吡格列酮干预组100．70±0．11∗0．71±0．57∗F49．92933．937P<0．001<0．001

*:与对照组比较，P<0.05；#:与吡格列酮干预组比较，P<0.05。

3 讨论

吡格列酮作为胰岛素增敏剂，广泛应用于糖尿病的治疗。其作用机制是高选择性地激动PPARγ，PPARγ的活化可调节许多控制葡萄糖及脂类代谢的胰岛素相关基因的转录。近来研究[1-2，4]显示，PPARγ作为调节糖代谢及脂类的转录因子，与2型糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化及肿瘤等慢性疾病的发生密切相关，其还具有显著的免疫调节和广泛的抗炎作用。有研究[5]证实PPARγ激动剂能抑制A549细胞释放趋化因子和细胞因子，降低IgE水平，减少黏液产生、胶质沉积，减轻哮喘患者气道炎症反应和气道高反应性。

气道黏液高分泌在哮喘的进展中发挥重要作用。MUC5AC起调控气道黏蛋白合成的作用，反映了气道黏液分泌的情况。GABA 是重要的抑制性神经递质。研究[6-7]表明GABA受体和GABA合成酶谷氨酸脱羧酶在气道上皮细胞中有表达，且组成了一个完善的GABA 系统；此系统参与了杯状细胞的增生和黏液的过度分泌。GABAAR的抑制减少了哮喘发作时气道上皮细胞黏液的分泌，并且抑制了气道重塑[8-9]。

气道炎症及气道重构是支气管哮喘的重要病理表现。该实验采用吡格列酮对哮喘模型小鼠进行干预，结果显示OVA激发的哮喘小鼠气道和肺组织中出现了明显的炎症反应和结构改变，如嗜酸粒细胞为主的炎症反应、黏液分泌增加以及气道壁增厚为主的气道重构；而吡格列酮干预组以上表现较哮喘组减轻，提示吡格列酮可能存在抗炎及抑制气道重构的作用，此种作用可能通过抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和TLR2表达，使TLR诱导的核因子NF-κB活性降低,下调趋化因子表达而实现[10]。作者观察到哮喘组肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA及蛋白表达水平均较对照组高，吡格列酮干预后以上指标均降低，GABAARα与MUC5AC变化趋势一致。由此推断，吡格列酮减轻气道黏液过度分泌的过程可能涉及GABAARα, 这对于解释哮喘的发病机制具有重要意义。吡格列酮可能通过下调GABAARα的表达在哮喘气道黏液过度分泌中起治疗作用，但是GABAARα的表达变化是吡格列酮直接调控的效果，还是由于吡格列酮抑制TLR-NF-κB信号通路激活、下调趋化因子表达进而产生的间接调控作用，仍需要进一步的研究。

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(2013-06-25 收稿 责任编辑 徐春燕)

Influence of pioglitazone on expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice

DUFangyu,LIUJianbo

DepartmentofRespiratoryDisease,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

GABAARα; MUC5AC;pioglitazone; asthma；mouse

Aim: To observe the effects of pioglitazone on the expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice, and to explore new ideas for prevention and treatment of asthma. Methods: Thirty BALB/C mice were randomly allocated into 3 groups(n=10):normal control group,the asthma group,and the pioglitazone intervention group. The latter 2 groups were established asthma model by sensitized and challenged with ovalbumin.The pioglitazone intervention group was given aerosol inhalation of pioglitazone 30 min before each allergen challenge. The pathological changes of the lung tissue were observed by HE staining. The expressions of GABAARα, MUC5AC mRNA and protein in lung tissue were analyzed by RT-RCR and immunohistochemistry. Results: The mice in the asthma group showed mucosal hyperemia and edema, mucosa thickening and severe airway inflammation. These changes alleviated in the pioglitazone intervention group．The expressions of GABAARα,MUC5AC protein and mRNA in the asthma group were higher than those of normal control group(P<0.05),and compared with those of the asthma group, the above indexes in the pioglitazone intervention group decreased but still higher than those in normal control group(P<0.05).Conclusion: Pioglitazone may play a role in the treatment of excessive mucus production through down-regulating the expression of GABAARα.

*河南省科技厅重点科技攻关项目 122102310236

R562.2+5

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.010