黑米花青素对结肠癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

刘春远 赵豹猛 蒋宏 崔云福

结直肠癌是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌，位居第二位。近年来随着饮食结构的改变、人口老龄化以及查体重要性的逐步认可，结肠癌发病率近年来有日益增高的趋势。花青素是一类多酚类化合物，广泛存在于各种瓜果蔬菜中，其水溶性好，生物利用度高，是目前为止所发现的最强的抗氧化剂和自由基清除剂，研究证明蓝莓花青素在防治多种疾病尤其是心脑血管疾病方面效果非常显著。近年来其抗肿瘤作用日益受到广大学者的重视，例如对胃癌、口腔癌、肺癌等肿瘤的作用明显。然而蓝莓价格昂贵不适合普遍推广，黑米中也含有丰富的花青素，而且我国是生产黑米最多的国家，这无疑为广泛推广创造了便利条件。但黑米花青素对肿瘤的抑制作用尤其是对结肠癌细胞的抑制作用尚缺乏相关研究。

材料与方法

一、一般资料

SW480结肠癌细胞株购自中科院上海细胞研究所；黑米花青素购自中山大学公共卫生学院，标准胎牛血清购中国杭州四季青公司。

二、方法

1.细胞增殖抑制分析：取对数生长期SW480细胞，接种于6孔培养板，培养24小时，弃去原液，分别加入浓度0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml含黑米花青素的RPMI-1640培养液，各浓度均设5个复组，用MTT法分别观察作用12h、24h、36h、48h和60h后，各组细胞增殖情况。细胞增殖抑制率计算公式如下：细胞抑制率(%)=(OD空白组—OD实验组)/OD空白组×100%。

2.细胞周期分析和凋亡检测：方法同细胞增殖抑制分析，分别于12h、24h、36h、48h和60h，经胰酶消化、70%乙醇固定，含碘化丙啶(PI)和R-Nase的PBS重悬细胞，用美国Coulter公司EPICS?倕XL流式细胞仪(FCM)进行细胞周期检测和凋亡检测。

三、统计学方法

所有数据采用SPSS13.0统计学软件包进行统计学分析，同一浓度黑米花青素不同作用时间的细胞增殖抑制率、细胞周期分布百分比以及细胞凋亡率的比较采用直线相关(Pearson)分析法进行统计学分析；不同浓度黑花青素相同时间的细胞增殖抑制率、细胞周期分布百分比以及细胞凋亡率的比较均采用样本率差别的统计检验，以α=0.05为检验水准，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、黑米花青素对SW480结肠癌细胞增殖的影响

MTT结果显示黑米花青素对SW480结肠癌细胞的增殖有明显的抑制作用，而且抑制作用有着明显的浓度依赖性和时间依赖性。两者呈高度直线相关关系，有统计学意义(P<0.01，图1)

二、黑米花青素对SW480结肠癌细胞周期的影响

流式分析结果显示黑米花青素可以使G2/M期细胞增多，同一浓度不同时间的G1/S期细胞随着与黑米花青素作用时间的延长逐步减少，G2/M期细胞相应逐步增多；不同浓度同一作用时间的细胞周期分布也不同，G2/M期细胞随着黑米花青素浓度的增加而增加(图1，表1)。不同浓度组48h细胞周期分布情况见图2～6。

图1 黑米花青素不同作用时间对SW480结肠癌细胞增殖抑制率曲线图

统计分析表明同一时间不同浓度组织间细胞周期构成比差异具有显著性、同一浓度不同时间点之间细胞构成呈直线相关关系，(P<0.01)。

表1 不同浓度黑米花青素组细胞周期百分率表

图2 0μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培养液组48h细胞周期分布直方图，与其他时间作用时间相比G2/M期细胞所占比率无明显变化，其比率为9.4%；图3 50μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培养液组48h细胞周期分布直方图，G2/M期细胞所占比率随作用时间延长逐渐增高，其比率为30.0%；图4 100μg/m黑米花青素的RPMI-1640培养液l组48h细胞周期分布直方图，G2/M期细胞所占比率随作用时间延长逐渐增高，其比率为44.3%；图5 150μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培养液组48h细胞周期分布直方图，G2/M期细胞所占比率随作用时间延长逐渐增高，其比率为49.5%；图6 200μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培养液黑组48h细胞周期分布直方图，G2/M期细胞所占比率随作用时间延长逐渐增高，其比率为54.0%

三、黑米花青素对SW480结肠癌细胞凋亡的影响

SW480结肠癌细胞细胞凋亡情况详见表2结果表明细胞凋亡率随着黑米花青素浓度和作用时间的增加而升高。与0μg/ml浓度组相比，其他各组细胞凋亡率均有显著统计学意义(P<0.01)，但当黑米花青素浓度增加到一定程度(150μg/ml)后，细胞凋亡率增加不再明显。不同黑米花青素组48h细胞凋亡情况见图7～11，M1亚峰为细胞凋亡峰。

表2 不同浓度黑米花青素组SW480，结肠癌细胞凋亡情况表

注：FL3-H为PE-TR荧光素通道

讨 论

结肠癌是一种严重威胁人民群众健康的消化道恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌，位居消化道恶性肿瘤第二位[1]。近年来由于生活条件的改善、饮食结构的改变、人口老龄化以及查体重要性的逐步认可，结肠癌的发病率有日益增高的趋势。疾病的治疗重在预防，恶性肿瘤更不例外，到目前为止只有少数恶性肿瘤可以得到永久治愈，大多数患者终将在数月到数年内死亡。因此如何预防肿瘤的发生显得尤为重要。任何恶性肿瘤的发生都是一个逐步渐进发生的过程，只要进行有效干预，它的发展可能就会终止、甚至消失；反之恶性肿瘤终将形成并威胁人类生命健康。有研究显示，纤维结肠镜检查发现60岁以上人群中，结肠息肉检出率高达50%[2]，而结肠息肉如不加控制就可能演变成结肠癌，但由于国情所限，大多数国人无法定期体检，大多数患者就诊时已经到疾病晚期。

花青素是一类多酚化合物，广泛存在于各种瓜果蔬菜中，其水溶性好，生物利用度高，是目前为止所发现的最强抗氧化剂和自由基清除剂，研究证明蓝莓花青素在防治多种疾病尤其是心脑血管疾病方面效果显著[3-4]。近年来其抗肿瘤作用日益受到广大学者的重视[5-8]，然而蓝莓价格昂贵鉴于我国实际不适合普遍推广。我国是世界上黑米产量最多的国家，同时黑米中花青素含量丰富，这无疑为广泛推广创造了便利条件。但黑米花青素对肿瘤的抑制作用尤其是对结肠癌细胞的抑制作用尚缺乏相关研究。

结肠癌和其它肿瘤一样，从本质上讲都是细胞周期调控失调的结果。正常情况下细胞的增殖和凋亡处于一种平衡状态，一旦平衡被打破，就会导致细胞增殖失控、细胞凋亡程序无法启动，并最终到导致肿瘤的产生。本研究通过黑米花青素对SW480结肠癌细胞在细胞增殖、凋亡和细胞周期三方面的影响，来阐述黑米花青素对结肠癌细胞的作用。细胞增殖影响结果显示：黑米花青素对SW480结肠癌细胞的增殖有明显的抑制作用，而且这种抑制作用随着黑米花青素浓度的升高而增高、随着作用时间的延长而增强，有明显的浓度依赖性和时间依赖性。这一结果与其他研究结果基本一致[9-10]，但其他学者只是观察到不同浓度花青素对肿瘤细胞增殖的抑制作用，而对于同一浓度花青素不同作用时间是否有差异未进行观察。本实验证明SW480结肠癌细胞的增殖率可以明显黑米花青素所抑制，这种抑制作用与花青素浓度和作用时间成直线正相关关系。

细胞周期(cell cycle)是细胞生命活动的基本过程，指从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程。典型的细胞周期可以分为四个时相，分别是：G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)，此外静止期细胞还包含G0期(休眠期)。任何一个环节出现阻滞，细胞周期就不能顺序进行，进而无法完成细胞分裂和增殖[11-12]。流式细胞仪对SW480结肠癌细胞周期和细胞凋亡率的检测表明，黑米花青素可以阻滞细胞周期的进行并促使结肠癌细胞启动凋亡程序引起细胞凋亡。本研究发现黑米花青素可以将SW480结肠癌细胞的细胞周期阻滞在G2/M期。但本研究发现黑米花青素对细胞凋亡的影响虽然也呈浓度和时间依赖性，但与细胞增殖抑制不同，当黑米花青素浓度达到一定值时，浓度的增加对凋亡率的影响逐渐减小。本研究发现浓度在200 μg/ml时虽然较150μg/ml时细胞凋亡率有所增加，但增加幅度并像细胞增殖抑制那样明显，作者认为这可能与黑米花青素影响SW480结肠癌细胞着壁有关，本研究观察到当黑米花青素浓度升高到一定程度，细胞着壁率是有所下降的。

本研究提示黑米花青素可能对人类抗击结肠癌细胞的战斗中发挥不可小觑的重要作用，但体内环境复杂多变，其效果如何，尚需进一步研究。

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