醋酸阿托西班制备工艺的研究

钟祥龙　张强　赵越　姜涛

[摘要] 目的 探讨醋酸阿托西班的固相合成工艺及纯化方法，以得到高纯度醋酸阿托西班。方法 采用Fmoc氨基酸为原料，采用固相合成方法，以Rink-AM树脂为载体，TBTU/HOBt为缩合剂催化合成直链肽，以碘/乙醇液为氧化剂，采用固相环化，两个游离单巯基的氧化生成二硫键而得到目标环肽，体积比例为95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water裂解，制得阿托西班粗品，液相分析粗品的纯度为86.24%，制备反相高效液相色谱法纯化，制得醋酸阿托西班，纯度>98%。 结果 合成醋酸阿托西班粗品，经制备反相高效液相色谱纯化，纯度>98%。 结论 该方法简单，合成成本低，纯度高，可用于工业化生产。

[关键词] 阿托西班；固相合成；HPLC；纯化；工艺研究

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0017-05

醋酸阿托西班注射液是由Ferring GmbH研制的一种新的抗早产药，为欧洲医药学会推荐的一线用药，是一种缩宫素的竞争性抑制剂，通过结合在子宫肌层和蜕膜的缩宫素受体上，阻止缩宫素在靶细胞上发挥作用，从而达到预防早产的疗效[1-3]。

阿托西班是一条由9个氨基酸组成的二硫键型的环肽多肽，是1，2，4和8位修饰的缩宫素分子，肽的N端为3-巯基丙酸（巯基与[Cys]6的巯基形成二硫键），C端为酰胺的形式。N端第二个氨基酸是乙基化修饰的[D-Tyr（Et）]2。阿托西班在药品中以醋酸盐的形式存在，通用名为醋酸阿托西班，肽序如下：

目前国内外专利或文献[4-6]所报道的大多数是通过固相化学合成方法来得到阿托西班，所以本研究采用Fmoc/tbu策略的固相化学合成路线，用逐步缩合的策略成功合成了九肽的阿托西班。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Synthware固相合成反应柱（北京欣维尔）；JJ1000型精密电子天平（常熟双杰测试仪器厂）；SHZ-Ⅲ循环水真空泵（巩义予华仪器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；液相分析仪器（岛津LC-10Avp）；液相分析色谱柱（岛津VP-ODS，4.6×150 mm）；JBR-1型多肽合成仪（海南建邦）。

1.2 试剂

Rink AM树脂（批号：GRMK0305，替代度：0.32 mmol/g，天津南开和成科技有限公司）；Rink AM树脂（批号：GRML0101，替代度：0.93 mmol/g，天津南开和成科技有限公司），Fmoc保护的氨基由上海吉尔生化科技有限公司提供，包括：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Orn（Boc）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr（Et）-OH、Mpa（Trt）-OH；缩合剂TBTU/HOBt由苏州中科天马肽工程中心有限公司提供；市售阿托西班进口制剂对照品（批号：AC0089G，生产厂家：Ferring GmbH）；哌啶、吡啶、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、苯甲硫醚（thioanisole）、苯酚（phenol）、乙二硫醇（EDT）、N，N-二异丙基乙胺（DIEA）、醋酸酐（AC2，O）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、冰乙醚和二氯甲烷（DCM）、二甲基亚砜（DMSO）和过氧化氢溶液（H2O2）均为分析纯；乙腈（色谱纯，天津科密欧试剂有限公司），超纯水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 阿托西班合成方法摸索

2.1.1 树脂类型的选择 因为阿托西班羧基端是肽酰胺的形式，常用有两种方法可以得到：①用2-氯三苯甲基氯树脂先组装肽链后，选择性切割成全保护的肽片段，然后在液相中将肽羧酸酰胺化，再脱除侧链保护基得到目标肽；②直接从氨基类树脂起始合成后，切割即得到目的肽酰胺。目前，氨基类树脂已实现工业化生产和供应，本研究选择步骤较少的方法②——选用Rink AM树脂作为固相合成的起始树脂[7-8]。

2.1.2 树脂的替代度选择 通常树脂的替代度高低选择是根据肽链的长短来选择合适的范围，阿托西班为九肽化合物，相对肽链较短。市售的Rink AM树脂替代度一般在0.3～0.9 mmol/g，据此选择低、高水平两种规格的Rink AM树脂（0.32 mmol/g，批号：GRMK0305；0.93 mmol/g，批号：GRML0101），按常规逐步偶联得到阿托西班肽树脂，再裂解得到阿托西班线形肽来进行对比试验，以肽树脂增重率、线型肽收率为考察标准，评价替代度水平高低对反应的影响（表1）。

由表1结果可见，0.32、0.93 mmol/g两种高低替代度规格的Rink AM树脂的合成结果在肽树脂增重率、线型肽收率方面有明显差别。因此，选用低替代度的Rink AM作为阿托西班固相合成的树脂载体。

2.2 氨基酸投料比的选择

文献中[4]报道的多为2～5倍的投料量，本实验设计了氨基酸投料比分别为2.0、3.0、4.0、5.0 eq. 4个水平的平行实验，条件见表2。通过逐步偶联得到阿托西班肽树脂，再裂解得到阿托西班线形肽，考察肽树脂增重率、固体线性肽收率及粗肽纯度等指标，来确定最优的投料比（表3）。

由表3结果可见，2.0、3.0倍氨基酸投料比，肽树脂增重率，线型肽收率及粗肽纯度均较低，而4.0、5.0倍氨基酸投料结果无明显差异且较高，结合成本因素，本研究选择4.0倍的氨基酸投料比。

2.3 激活剂的选择

多肽合成中的激活剂大多数是通过活化羧基完成肽键缩合反应，目前可用于肽键缩合的试剂和缩合方法较多，常见的有酰基叠氮物法、酸酐法、碳二亚胺法、活化酯法、磷鎓盐试剂法、脲鎓盐试剂法等[9-10]。这些缩合方法及缩合试剂均具有各自的特点，综合成本、激活效率、安全因素等考虑，本研究采用TBTU/HOBt组合来作为主要的激活剂。

2.4 温度和反应时间的确定

多肽缩合反应为较温和的化学反应，对温度要求并不苛刻，通常的洁净区的18～26℃温度范围内均是较适宜的反应温度；在此温度范围内，每个氨基酸偶联的时间可以通过经典的游离氨基检测方法——茚三酮（Kaiser test）检验法来确定偶联反应终点，此方法的灵敏度及准确度已经得到研究者一致认可[11]。

2.5 裂解过程捕获剂的选择

肽链组装完毕后需要用强酸[Fmoc/tBu化学通常选用三氟乙酸（TFA）作为酸切割剂]将肽链从树脂上释放出来，在切割肽的同时侧链保护基团也会被相应的脱除，这时需要捕获剂来捕获侧链保护基团形成的正碳离子等活性离子，以避免其再次与多肽氨基酸残基的活性侧链基团结合生成副产物，根据Fmoc/tbu策略选择的氨基酸侧链保护基团主要有三苯甲基（Trt）、叔丁基（tBu）、叔丁氧羰基（Boc）3种，根据文献报道[9]，常用乙二硫醇和水作为捕获剂，因此选择EDT和水作为捕获剂。

裂解液的组成为TFA/EDT/Water=95/2.5/2.5（v/v）。

2.6 环化方法筛选

阿托西班结构中含有一对二硫键，其形成是通过两个游离单巯基的氧化得到。氧化方法按载体分主要有固相环化法与液相环化法[7，12-13]两种。环化方法需要选择的条件包括氧化剂、环化浓度、pH等。

本实验设计了用碘作为氧化剂的固相环化和液相环化两种方法，其中液相环化又设计了线型肽溶解浓度分别为0.5、1、5 mmol/L 3个水平的平行环化实验，所使用的肽树脂合成方法参见表4，环化实验条件参见表5，通过比较环化粗肽纯度来选择最佳的方法或浓度。

首先按表4的合成条件完成肽树脂的偶联，再按表5环化条件进行固相或液相环化。液相环化反应的效果和反应终点，可以用HPLC来监测，固相环化的环化效果则需采用先取样裂解后再通过HPLC检测的方法，HPLC分析色谱条件参见“2.3”项下，实验结果见表6。

由表6可见，固相环化和低肽浓度液相环化的纯度都比较高，考虑到操作方便，本研究采用固相环化的方法，氧化剂为碘/乙醇液。

2.7 阿托西班合成方法的步骤

2.7.1 Fmoc-Gly-rink-AM resin 树脂的制备 以0.32 mmol/g Rink AM为载体，用DMF溶胀30 min，抽去；DMF洗涤树脂2次，每次2～5 min。

2.7.2 Atosiban -rink-AM resin 树脂的制备 加入20%PIPE/DMF脱Fmoc保护15 min；去Fmoc保护后洗涤，用DMF洗涤树脂3次抽干，每次2～5 min，茚三酮检测显蓝黑色；配制氨基酸偶联液，以4倍的氨基酸投料比，称取Fmoc-Gly-OH和HOBt，加入DMF混合溶解澄清，缓慢加入TBTU，混匀后加入到盛有树脂的反应器中，开始偶联反应；反应2 h后，取少量树脂洗涤后，茚三酮监测反应终点，当树脂及溶液不显色，表明反应完全；偶联完毕后，DMF洗涤1次，2～5 min。按照阿托西班氨基酸序列自C端向N端依次在树脂上偶联，直到最后Mpa偶联完毕，加入20%PIPE/DMF脱Fmoc保护15 min；DMF洗涤3次，每次2～5 min，DCM洗涤3次，每次2～5 min，抽干树脂；树脂抽真空30℃以下干燥[7，14]。

2.7.3 线型肽树脂环化 环化：线型肽树脂中加入5%醋酸水溶液，配制碘/乙醇溶液，滴加至上述肽溶液中，1 h后，HPLC监测环化终点，氧化完毕得到Atosiban-rink-AM resin。

2.7.4 Atosiban-rink-AM resin 树脂的裂解 配制体积比例为95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water，数量为15 ml/g肽树脂，冰浴下加入到干燥的树脂中，加入完毕后升温至室温反应150 min，过滤树脂，用TFA少量洗涤树脂，合并滤液，浓缩除去大部分三氟醋酸后，倾入冷的乙醚中析出沉淀，离心收集沉淀，用冷乙醚洗涤沉淀3次，真空干燥[15-16]，得Atosiban粗品；收率为106.89%。经过液相分析得到环肽粗品的纯度为86.24%。

2.8 醋酸阿托西班粗品纯化

2.8.1 阿托西班粗品溶液成分鉴定分析 对阿托西班粗品水溶液进行分析（图1），色谱条件具体如下。流动相A：0.1%TFA水溶液；流动相B：乙腈，B相30%～45%，梯度洗脱30 min；紫外检测波长：215 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：室温[17-18]。再用市售制剂醋酸阿托西班注射液（批号：AC0089G）作为对照品以确定样品的出峰位置，得到色谱图（图2）。通过与样品色谱图比较，证明粗品液中保留时间为12.8 min峰为目标产物。

2.8.2 阿托西班粗品水溶液的纯化制备 将约含2 g阿托西班的粗品水溶液，用制备反相高效液相分离纯化，制备柱Novasep，色谱条件具体如下。流动相A：0.1%TFA水溶液；流动相B：乙腈，B相24%～34%，梯度洗脱60 min；紫外检测波长：230 nm；流速：70.0 ml/min；柱温：室温。分段收集目标峰，经高效液相检测合并组分，最后得到主峰纯度>98%的组分。

3 讨论

多肽的固相合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从羧基端（C端）向氨基端（N端）合成。固相合成法虽然减轻了每步产品提纯难度，但无法纯化中间体，终产物必须纯化[19]。

本研究对Fmoc/tbu的固相合成路线主要关键参数进行摸索和工艺条件确定，摸索的关键参数包括树脂类型、树脂替代度、氨基酸投料比、激活剂种类、反应温度与反应时间、环化方法以及捕获剂种类。选用的低替代度Rink AM树脂作为固相合成的起始树脂，步骤较少，易实现工业化生产和供应。4.0倍的氨基酸投料比，纯度及产率高，选用TBTU/HOBt组合来作为主要的激活剂，安全有效。茚三酮检验法来确定偶联反应终点，方法灵敏及准确，碘/乙醇固相环化方法，得到粗品纯度高。经制备型高效液相纯化后，纯度达98%以上，总收率高，可为工业化生产提供借鉴。

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（收稿日期：2014-05-23 本文编辑：林利利）

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（收稿日期：2014-05-23 本文编辑：林利利）

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（收稿日期：2014-05-23 本文编辑：林利利）