维生素D受体基因多态性与肺腺癌易感性的关系

刘静波 侯燕燕 齐曦明 唐利娟 周文文 彭勇 杨雁鸿

·论著·

维生素D受体基因多态性与肺腺癌易感性的关系

刘静波 侯燕燕 齐曦明 唐利娟 周文文 彭勇 杨雁鸿

目的探讨维生素D受体(VDR)等位基因多态性与肺腺癌易感性的关系。方法172例河北汉族肺腺癌患者和180例健康对照。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性的方法对VDR的Bsm1、Fok1等位基因多态性与肺腺癌的关系进行研究。结果肺腺癌组VDR基因Bsm1位点基因型分布、等位基因分布Fok1位点基因型分布与健康对照组比较差异有统计学意义(χ2值分别为8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位点基因型分布，其等位基因分布与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论VDR基因Bsm1位点多态性与肺腺癌发病风险相关联。Bsm1位点B等位基因可能增加肺腺癌的发病风险。VDR基因Fok1位点多态性与肺腺癌发病风险可能关联。

多态性;维生素D;肺肿瘤;易感性

肺癌作为临床最为常见的恶性肿瘤，其病死约占所有癌症死亡的17.8%，据相关资料统计，我国目前每年新发数约有50万，呈逐年递增趋势[1]。其中75%～85%的肺癌发病中为非小细胞肺癌，2/3确诊时已属晚期[2]。而肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见、预后最差的类型之一，据研究资料表明，肺腺癌发病率呈明显上升趋势，在很多国家超过了鳞癌成为最常见的肺癌组织学类型。VDR是核受体超家族的成员，已有大量研究表明，VDR基因多态性与多种肿瘤的发生、发展有明显的相关性[3]。本实验拟研究VDR基因多态性与肺腺癌易感性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年10月至2013年3月，秦皇岛市第一医院肿瘤科住院的晚期腺癌患者(均为ⅢB期/Ⅳ期)172例，所有病例均有病理学诊断依据，除外其他癌症患者及合并糖尿病、心血管疾病等。对照组为同期随机在秦皇岛市第一医院体检中心进行体检的健康体检者180例。病例组及健康对照组均来自秦皇岛市及周边的中国汉族人。肺腺癌组中，男82例，女90例；平均年龄(64±11)岁。对照组中，男85例，女95例；平均年龄(63±11)岁。2组一般资料有均衡性。

1.2 方法 采用外周血DNA提取试剂盒提取DNA，Marker ⅠDNA 及ladder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司产品，TaqDNA聚合酶和其缓冲液及4dNTPs购自Promega，Bsm1及Fok1限制性内切酶购自Biolabs。引物的序列由基因库公布的VDR基因序列合成，并采用DNAman的程序设计，合成公司为北京鼎国昌盛生物公司。最后根据酶切结果挑选各个位点不同基因型的PCR产物进行测序，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司完成，以验证扩增产物为目的片段并且确定基因型。先采集外周静脉全血2 ml，然后用外周血DNA分离试剂盒来提取DNA。Bsml位点PCR反应体系的总量为25 μl，Fok1位点PCR反应体系的总量为25 μl，其中有基因组DNA、TaqDNA聚合酶和引物TaqDNA聚合酶缓冲液。Bsml上游的引物(5’-3’)为GGCAACCTGAAGGGAGACGTA，下游的引物(5’-3’)为CTCTTTGGACCTCATCACCGAC。通过编好程序的PCR仪进行PCR扩增，其反应参数如下：Bsml位点PCR反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸40 s，共计30个循环。最后一个循环为72℃延伸5 min。Fok1上游的引物(5’-3’)为CTCCGAAGGCACTGTGCTCAGGCCT,下游的引物(5’-3’)为ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC。其反应参数如下：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共计30个循环。最后一个循环为72℃延伸10 min。Bsml位点及Fok1位点的PCR产物分别加入相应的限制性内切酶5 μl和缓冲液，Bsm1位点限制性内切酶的产物在65℃恒温箱16 h，然后对酶切产物电泳。Fok1位点限制性内切酶的产物在37℃恒温箱16 h，然后对酶切产物电泳。

1.3 结果判断 VDR基因的第8内含子rs1544410位点多态性对应Bsml限制性酶切位点位点为碱基A→G突变。65℃恒温箱16 h，A等位基因纯合子表现为461 bp一个条带，命名为BB基因型；G等位基因纯合子表现为258 bp和 203 bp两个条带，命名为bb基因型；杂合子状显示为 461 bp， 258 bp，和203 bp3个条带，命名为Bb基因型。VDR基因的第2外显子rs10735810位点多态性对应Fok1限制性酶切位点，为碱基T→C的突变。T等位基因纯合子表现为265 bp一个条带，命名为FF基因型；C等位基因纯合子显示为207 bp和60 bp2个条带，命名为ff基因型；杂合子显示为 265 bp，207 bp和60 bp3个条带，命名为Ff基因型。

1.4 统计学分析 应用SAS 9.2统计软件，病例组与对照组组间VDR基因型分布概率的比较采用χ2检验，关于肺腺癌的危险的因素，选择应用非条件Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bsm1及Fok1酶切后的电泳结果 Bsm1位点各基因型的条带数目和位置见图1，Fok1位点各基因型的条带数目和位置，见图2。

2.2 VDR Bsm1位点及 Fok1位点基因型分布 病例组VDR基因Bsm1位点基因型分布、等位基因分布Fok1位点基因型分布与对照组比较差异有统计学意义(χ2值分别为8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位点基因型分布，其等位基因分布与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨论

VDR是介导1,25(OH)2D3发挥生物学效应，为甲状腺激素、类固醇激素受体超家族成员。维生素D在正常组织内有促进细胞分化、抑制细胞生长的作用[4]，这种功能受转录调节因子VDR 的调节。1,25(OH)2D3即活性维生素D在体内具有多方面的活性，可维持钙、磷平衡和骨代谢。此外，1,25(OH)2D3在肿瘤的预防和治疗方面也起着重要作用[5-7]。许多体内、体外实验都证实了1,25(OH)2D3对肺癌的抑制作用[8]。VDR基因多态性的相关性研究主要集中在骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、肿瘤、佝偻病及尿石症等疾病方面。核受体状况可能成为NSCLC的预后指标。评估VDR基因多态性对VDR表达的影响，需要针对维生素D信号通路可能是通过在目标肺癌组织中VDR的身份影响治疗[9]。目前检测的VDR基因多态性酶切的位点分别为Cdx-2、Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。

图1 VDR-PCR产物经Bsm1酶切后的电泳图

图2 VDR-PCR产物经Fok1酶切后的电泳图

表1 2组人群VDR的Bsm1及Fok 1基因多态性分布 例

本研究应用Bsm1和Fok1限制性内切酶对河北秦皇岛籍汉族172例晚期肺腺癌及180例健康成人的VDR基因多态性进行对比分析，结果发现两组VDR基因Bsm1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险相关联。Bsm1位点B等位基因可能增加肺腺癌的发病风险。VDR基因Fok1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险可能关联。这一结果与Dogan等[10]的研究结果不一致，Dogan发现降低VDR活性的Taq1多态性基因可能是患肺癌的危险因素，而性别、年龄、吸烟可能加重这一因素的影响。Zhou等[11]发现VDR基因多态性与早期肺腺癌患者生存率之间无明显关联，VDR基因多态性可能与早期NSCLC的鳞状细胞癌患者的生存率提高有关。VDR与肺癌相关性的研究目前国内尚未见报道。近年国内外有大量关于VDR基因的研究报道，显示VDR基因位点的基因型及等位基因的分布因人种不同而差异较大[1-5]。如Bsm1位点，我国人群中等位基因B频率约为10%，略低于日本人(15%～20%)，与韩国人相近(约11%)。而在高加索人群中，等位基因B频率可达35%以上。就基因型比例，我国人群中bb型较多，达90%以上，Bb型次之，而BB型低于2%。而在高加索人群中，则以Bb型居多，约45%～55%，BB型为18%以上。本研究结果与部分文献报道出现的结果不同，其原因可能为秦皇岛坐落于中国河北省的东北部，其季风气候为暖温带半湿润大陆性，也可能与研究对象的种族差别、环境暴露因素、接触致癌因素的迥同及未省的混同因素有关[12-15]。需要在其他不同人群中反复实验以及进一步扩增样本量继续进行研究，来进一步验证实验结果。

1 朱洪源，陈成．晚期非小细胞肺癌的药物治疗进展．中国现代医学杂志，2011，21：4154-4157．

2 韩晓，王哲海．非小细胞肺癌组织学亚型与药物疗效关系．肿瘤防治研究，2010，37：1084-1087．

3 Shields PG．Molecular epidemiology of smoking and lung cancer．Oncogene，2002，2 1：6870-6876.

4 Nagpal S，Na S，Rathnachalam R．Noncalcemic actions of vitamin D receptor ligands．Endocr Rev，2005，26：662-687.

5 Bouillon R,Eelen G,Verlinden L,et al.Vitamin D and cancer.Steroid Biochem Mol Biol,2006,102:156-162.

6 Krishnan AV,Trump DL,Johnson CS,et al.The role of vitamin D in cancer prevention and treatment.Endocrinol Metab Clin North Am,2010,39:401-418.

7 Davis CD,Milner JA.Nutrigenomics,Vitamin D and cancer prevention.J Nutrigenet Nutrigenomics，2011,4:1-11.

8 陈佳琦,张力.维生素D对肺癌的抑制作用.国际呼吸杂志,2010,30:1375-1379.

9 Srinivasan M,Parwani AV,Hershberger PA,et al.Nuclear Vitamin D Receptor Expression is Associated with Improved Survival in Non-Small Cell Lung Cancer.Steroid Biochem Mol Biol,2011,123:30-36.

10 Dogan I,Onen HI,Yurdakul AS,et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and risk of lung cancer.Med Sci Monit,2009,15:BR232-BR242.

11 Zhou W,Heist RS,Liu G,et al.Polymorphisms of Vitamin D receptor and survival in early-stage non-small cell lung cancer patients.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15:2239-2245.

12 李榕，楼煜清，颜波，等.维生素D受体基因多态性位点rs7975232与肺癌发病风险的相关性.中国医药，2013，8：1390-1392.

13 杨雁鸿，周文文，唐利娟，等.维生素D受体基因多态性与吸烟因素交互作用对非小细胞肺癌发生的影响.中国老年学杂志，2013，33：3844-3846.

14 蒋普，蒋过亿.1，25二羟基维生素D3对肺癌抑制作用.检验医学与临床，2013，10：998-1000.

15 康晓征，陈克能.维生素D对肺癌的抑癌机制.国际肿瘤学杂志，2012，39：594-597.

RelationshipbetweengenepolymorphismsofvitaminDreceptorandsusceptibilityoflungadenocarcinoma

LIUJingbo*,HOUYanyan,QIXiming*,etal.*TheFirstHospitalofQinhuangdaoCity,Hebei,Qinhuangdao066000,China

ObjectiveTo explore the correlation between gene polymorphisms of vitamin D receptor (VDR) and susceptibility of lung adenocarcinoma.MethodsThe 172 patients with lung adenocarcinoma (lung adenocarcinoma group) and 180 healthy subjects (control group) were enrolled in the study,and all the subjects were Chinese Han people in Hebei province. The correlation between allele polymorphism of Bsm1,Fok1 site of VDR and lung adenocarcinoma was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThere were significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (χ2=8.111 and 6.492,P<0.05). However there were no significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (P>0.05).ConclusionBsm1 gene site polymorphism of VDR gene is closely correlated to pathogenesis risk of advanced lung adenocarcinoma. Bsm1 B allele may increase the pathogenesis risk of lung cancer.Fok1 site polymorphism of VDR may be related with pathogenesis risk of lung cancer.

polymorphisms; vitamin D;lung neoplasms; susceptibility

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.007

066000 河北省秦皇岛市第一医院(刘静波、齐曦明、唐利娟、杨雁鸿)；承德医学院(侯燕燕、周文文)；燕山大学(彭勇)

杨雁鸿，066000 河北省秦皇岛市第一医院；

E-mail：yyh_0615@163.com

R 734.2

A

1002-7386(2014)12-1780-03

2013-12-16)