阿霉素、5-氟尿嘧啶联合热疗对SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响

张继新，庞志刚，刘 超，刘新江，尚 闯，耿 翔

郑州大学第二附属医院普外科 郑州 450014

阿霉素、5-氟尿嘧啶联合热疗对SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响

张继新，庞志刚#，刘 超，刘新江，尚 闯，耿 翔

郑州大学第二附属医院普外科 郑州 450014

#通讯作者，男，1963年7月生，硕士，主任医师，教授，研究方向：原发性肝癌，E-mail：pzg63726@sina.com

阿霉素；5-氟尿嘧啶；热疗；热化疗；SMMC-7721细胞；细胞增殖；细胞凋亡

目的：探讨阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)联合热疗对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。方法SMMC-7721细胞分为对照组、单纯热疗组、5-FU+ADM组、ADM+热疗组、5-FU+热疗组、5-FU+ADM+热疗组，各组热处理均为43 ℃水浴1 h再37 ℃培养23 h。各组处理24 h后采用MTT法检测细胞的增殖，计算增殖抑制率，采用流式细胞术检测细胞凋亡，计算凋亡率。结果5-FU+ADM+热疗组细胞增殖抑制率高于单纯热疗组、5-FU+ADM组、ADM+热疗组、5-FU+热疗组[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%、(55.04±1.89)%、(40.21±2.27)%、(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]。5-FU+ADM+热疗组的细胞凋亡率高于单纯热疗组、5-FU+ADM组、ADM+热疗组、5-FU+热疗组[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%、(65.40±2.05)%、(49.32±1.76)%、(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)]。结论加热能增强5-FU联合ADM化疗对SMMC-7721细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用，其效应优于单纯热疗或ADM与5-FU联合以及单纯化疗联合热疗。

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。该病起病隐匿、发展较快，侵袭性强、复发率高、治疗较难，目前尚缺乏有效的治疗药物，因此寻找安全有效的治疗方法已成为目前研究的重点。肿瘤热疗有“绿色疗法”之称[1]。研究[2-3]已证实，热疗能显著提高肿瘤对化疗药物的敏感性及化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，但现有研究仅限于单种化疗药物联合热疗。已有文献[4-5]报道化疗药物联合热疗对肝癌细胞的杀伤作用明显高于单独化疗。阿霉素(adriamycin,ADM)与5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床常用化疗药物。作者观察了ADM与5-FU联合化疗再结合热疗对人肝癌SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响，为肝癌的临床治疗提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1材料SMMC-7721细胞株由河南省肿瘤医院中心实验室提供；注射用盐酸ADM(辉瑞制药有限公司产品)，5-FU(美国Sigma公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司), 二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司), AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(联科生物公司)。

1.2细胞培养和分组将SMMC-7721细胞置于配制好的含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，放入37 ℃、体积分数5%CO2、湿度80%培养箱中培养。每2 d换液1次，2～3 d传代。实验分组及处理方法：实验设6组，每组6个复孔，独立重复3次。取对数生长期的SMMC-7721细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集细胞，调细胞密度至3×104mL-1，接种于96孔板中，每孔内加150 μL细胞悬液。①对照组：加入细胞悬液及50 μL培养液，不加任何药物。空白对照仅加入培养液，用于机器调零。②单纯热疗组：加50 μL培养液置于43 ℃恒温培养箱中培养1 h，热处理后继续置入培养体系(37 ℃，下同)中培养23 h。③5-FU+ADM组：加入含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培养液共50 μL，于培养体系中培养24 h。④ADM+热疗组：加入50 μL含1 mg/L ADM的培养液，置于43 ℃恒温培养箱中培养1 h后继续置入培养体系中培养23 h。⑤5-FU+热疗组：加50 μL含0.25 g/L 5-FU的培养液，置于43 ℃恒温培养箱中培养1 h后继续置入培养体系中培养23 h。⑥5-FU+ADM+热疗组：加入50 μL含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培养液后，置于43 ℃恒温培养箱中培养1 h后继续置入培养体系中培养23 h。

1.3细胞增殖抑制率测定细胞按1.2中分组处理，各组最终容积为200 μL。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL继续培养4 h后终止培养，弃上清液，加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min；检测490 nm处各孔的吸光度(A)值，计算增殖抑制率。增殖抑制率=[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100%。采用协同作用q值[6]判断化疗与热疗联合应用的性质。q=E(CD)/(EC+ED-EC×ED),式中E(CD)为ADM与5-FU联合热疗的增殖抑制率, EC为单纯热疗组的增殖抑制率，ED为ADM和5-FU联合化疗的增殖抑制率。q<0.85示两者有拮抗作用，0.85≤q≤1.15示两者有相加作用，q>1.15示两者有协同作用。

1.4细胞凋亡检测细胞按1.2中分组处理后，每组收集5×105个细胞，经胰蛋白酶消化后移入10 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min；弃上清液，加入PBS液，1 000 r/min离心10 min，前后共离心、洗涤细胞2次；向洗涤后的细胞中加入1 mL Binding buffer，然后加入10 μL AnnexinV/FITC和5 μL PI。轻轻混匀，在室温避光条件下反应15 min。应用流式细胞仪检测凋亡细胞，计算凋亡率。

1.5统计学处理应用SPSS 17.0处理数据。各组间细胞增殖抑制率和凋亡率的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞增殖抑制率和凋亡率比较见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率与凋亡率比较(n=3) %

*:与5-FU+ADM+热疗组比较，P<0.01。

2.2协同作用热疗与ADM及5-FU联合应用时在抑制SMMC-7721细胞增殖中的q值为1.17。

3 讨论

热疗为一种新的肿瘤治疗方法，被称为继手术、化疗、放疗和生物治疗之后的第5种肿瘤治疗模式[7]。人体正常细胞和癌细胞对热的耐受性和敏感性存在明显差异[8-9]。热疗对肿瘤细胞的杀伤作用取决于温度和时间，药物对癌细胞的杀伤作用具有时间依赖性。已证明[10]，42～43 ℃对肿瘤细胞的杀伤力最强。有研究[11]表明43 ℃药物作用60 min时对胃癌细胞的杀伤作用已接近最大。也有研究[12]表明全身治疗的恒温期治疗时间为1 h。Nikfarjam等[13]对肝癌细胞加热后发现，其细胞凋亡可持续96 h，并在24 h达到高峰。结合临床实际情况及患者的耐受性，该实验以温度43 ℃ 60 min后继续培养23 h为热疗条件。

5-FU目前仍是肝癌化疗的首选药物，可阻滞G1期细胞向S期转化的进程，而热疗与5-FU联合应用既能抑制细胞周期G1的进程又能抑制S期细胞，从而使G2/M期细胞增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应[14]。ADM是肿瘤细胞有丝分裂S期非特异性阻滞药物，主要作用机制是在DNA合成过程中诱导TOPOⅡ抑制剂-DNA断裂物复合物的形成，引起细胞死亡或停滞于S期、G2期[15-16]。热疗与化疗协同作用的机制在于：化疗对富氧细胞的敏感性高于乏氧细胞，热疗对乏氧细胞的敏感性高于富氧细胞，因此化疗配合热疗既可杀灭富氧细胞又能杀灭乏氧细胞；热疗可使细胞膜蛋白变性、细胞膜稳定性破坏、通透性升高、物质转运障碍、呼吸抑制、酸中毒，从而使化疗药物进入细胞内的量增多，增加了细胞毒作用，加强了化疗效果[17]；热疗还可增加血供，促进化疗药物局部积聚摄取和加快反应速度；热化疗共同促进癌细胞凋亡的发生[18]；热化疗可增加对癌细胞的杀伤，并降低癌细胞的多种药物抗药性[19]。

该实验结果显示，热疗联合两种化疗药物可以显著提高人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制率及凋亡率，且效果较单纯热疗、两种化疗药物联合及单种化疗药物联合热疗好。热疗和化疗联合有很好的互补性，但我国肿瘤热疗研究尚处于初级阶段。如何把当前热疗方法与化疗相结合，根据肿瘤细胞的种类及生物学特性选择最合适的化疗联合方案、最佳的热疗温度及时间以及热疗和化疗应用的先后顺序及间隔时间，仍是下一步研究的重点。

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(2013-10-20收稿 责任编辑徐春燕)

Effect of adriamycin and 5-fluorouracil combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells

ZHANGJixin,PANGZhigang,LIUChao,LIUXinjiang,SHANGChuang，GENGXiang

DepartmentofGeneralSurgery，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

adriamycin;5-fluorouracil;hyperthermia;thermo-chemotherapy;SMMC-7721 cell;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To study the effect of adriamycin(ADM) and 5-fluorouracil(5-FU) combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells. Methods: SMMC-7721 cells were allocated into 6 groups：control group，pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group, 5-FU+ADM+hyperthermia group. The cell proliferation inhibition effect was evaluated by MTT assay.The apoptosis of SMMC-7721 cells were determined by flow cytometry. Results: The cell proliferation inhibition rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%,(55.04±1.89)%,(40.21±2.27)%,(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]; the apoptosis rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%,(65.40±2.05)%,(49.32±1.76)%,(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)].Conclusion: ADM and 5-FU combined with hyperthermia can increase the inhibition effect on proliferation and induce apoptosis of SMMC-7721 cells compared with pure hyperthermia, or ADM and 5-FU combination or single chemotherapy combined with hyperthermia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.020

R735.7