长春地区奶牛乳腺炎主要致病菌分离鉴定及药敏试验

刘春杰 杨丽华 张春 刘靓 王贵 李景思

摘 要 试验旨在研究长春地区奶牛乳腺炎主要病原菌的种类、分离鉴定和药敏试验，初步探讨了奶牛乳腺炎的发病原因及防治措施。随机选择长春周边地区不同泌乳期黑白花奶牛50头，按常规挤奶消毒，以被检乳区为单位进行采样。对乳样中细菌进行分离培养，鉴定主要致病菌，并进行药敏试验。结果表明：乳样中分离到3种主要病原菌，其中金黄色葡萄球菌占分离菌株的67.35%；大肠杆菌占24.49%；链球菌占8.16%。药敏试验结果表明分离到的主要病原菌对氨苄青霉素不敏感，近100%耐药。金黄色葡萄球菌和链球菌对四环素、痢特灵、红霉素产生耐药性；大肠杆菌对先锋霉素Ⅵ和环丙沙星敏感性较高。结论：在治疗奶牛乳腺炎时应尽量交叉用药，防止产生耐药性，并努力开辟新的预防和治疗方法。

关键词 奶牛；乳腺炎；病原菌；分离鉴定；药敏试验；长春地区

中图分类号：S858.23 文献标志码：A 文章编号：

奶牛乳腺炎是一种复杂的、造成奶牛业经济损失最严重的疾病之一。该病从发现至今已有150多a的历史。根据世界奶牛协会公布的数据显示，全球约有50%左右奶牛患有乳腺炎，每年因乳腺炎原因使牛奶产量降低达380万 t。我国奶牛乳腺炎的发病率平均为70%左右，明显高于世界平均水平，且每头奶牛平均减少奶量约为10%～15%。此外，治疗奶牛奶牛乳腺炎的医药费数量也相当巨大。据报道，在美国治疗临床型乳腺炎每头奶牛约需37.96美元，而我国每例乳腺炎平均需医药费23元[1]。除此外，乳腺炎的发生还会使奶牛产后发情和妊娠时间延长，牛奶营养成份下降以及对人类的健康造成危害，这些都是无法估计的巨大损失。奶牛乳腺炎的发病原因多种多样，但大多数是由病原微生物引起的[2]，其病原种类具有显著的地域性，由此，就长春地区引起奶牛乳腺炎的病原菌进行分离鉴定并进行药敏试验，为开发研制治疗奶牛乳腺炎的药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌购于ATCC。试验用琼脂粉、牛肉浸膏、蛋白胨、水解酪蛋白、可溶性淀粉、甘露醇等均为分析纯。MH琼脂、MH肉汤、绵羊血琼脂平板、和标准比浊管等按有关文献配制[3]。糖发酵管等生化鉴定所用的微量发酵管和部分药敏试纸片购自杭州微生物试剂有限公司，部分药敏纸片按常规方法自制。

1.2 试验仪器

ZSD-A1090，上海智诚生化培养箱、HS-840U，苏州净化设备有限公司超净工作台；4℃冰箱青岛海尔BCD-215KS；BSA-224S电子天平，德国赛多利斯；日本三洋立式高压灭菌锅MLS-3780，；上海新苗DNP-9162BS-III 数显式鼓风干燥箱。

1.3 试验方法

1.3.1 乳样采集

在长春周边地区几个奶牛场随机挑选60头处于不同泌乳期的荷斯坦奶牛进行乳采集，奶牛按常规挤奶方法，每日人工挤奶2次，以被检乳区为单位进行采样。用温热的湿毛巾搽洗乳房，将挤奶员的手指和奶牛乳头用碘伏消毒，再用75%酒精棉球脱碘。采集乳样前头2～3把奶弃去，采用无菌操作手法，每个乳室取乳样5～6 mL置于灭菌青霉素药瓶中，加盖密封，标明采样日期、牛号、乳室等，迅速将乳样置于冰袋上带回实验室进行细菌培养和有关检测试验[4-5]。

1.3.2 分离培养细菌

将分装于青瓶中无菌采集的乳样摇匀，在无菌环境下用接菌环划线接种于绵羊血琼脂、伊红-美兰琼脂、麦康凯琼脂、甘露醇琼脂平板上，做上标记，置于37℃恒温箱培养24～48h后观察菌落形态。对可疑菌落进行革兰氏染色涂片，镜检。对呈现革兰氏阳性和阴性菌按常规方法分别进行纯培养。将镜检无杂菌的菌落接种于血琼脂斜面上，37℃恒温培养18～24h后4℃保存，用于鉴定。

1.3.3 致病菌鉴定

1.3.3.1 形态学观察

根据细菌在培养基上的生长形态、生长特征和镜检结果等情况，将分离出来的菌进行初步划分，分为葡萄球菌、链球菌、肠杆菌属，为进一步生化鉴定初步确定鉴定项目[6-7]。

2.1.2.2 生化鉴定

将纯培养分离的细菌进行涂片染色镜检，以检验其纯度。采用细菌触酶试验、兔血浆凝固酶试验、甘露醇发酵生化鉴定管等进行鉴定疑似葡萄球菌属细菌；采用三糖铁、吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐发酵试验等进行鉴定疑似大肠杆菌属细菌[8-9]。

1.3.4 药敏试验

采用临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准，利用琼脂纸片扩散法，检测分离得到的3类细菌对四环素、红霉素、环丙沙星、庆大霉素、青霉素、痢特灵与先锋霉素Ⅵ等几种药敏纸片的敏感度。用卡尺测量抑菌圈直径（φ），φ大于15 mm为极敏感；10 mm>φ>15 mm为高度敏感；10 mm>φ>8 mm 为敏感；φ>8 mm为不敏感[10]。

2 结果

2.1 细菌分离结果

本试验共采集乳样100份，进行样品中病原菌的细菌分离培养，分别获得3种主要病原菌共98株，金黄色葡萄球菌66株，占分离株的67.35%；大肠杆菌24株，占分离株的24.49%；无乳链球菌8株，占分离株的8.16%（见表1）。

2.2 生化鉴定结果

根据镜检观察的菌落形态特征，将对疑似葡萄球菌和大腸杆菌菌落，进行增菌后纯化培养，将纯培养菌落进行生化鉴定。将镜检结果与各株细菌培养特性分析后，确定分离到的菌株为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌[11]、大肠杆菌和克雷伯氏菌[12]。

2.3 药物敏感试验

采用药敏试验，将通过生化鉴定的98株细菌分别进行试验，依据CLSI的药敏判定标准，比较各株细菌抑菌圈直径大小。结果显示分离到的3种主要病原菌对氨苄青霉素完全不敏感，几乎100%耐药。金黄色葡萄球菌和无乳链球菌对四环素，痢特灵，红霉素有一定耐药性；多数抗菌素对大肠杆菌也缺乏抗菌作用。但多数菌株对先锋霉素Ⅵ和环丙沙星较敏感，尤其对头孢拉定的敏感程度最高，接近100%（见表2）。

3 小结与讨论

从乳样中分离鉴定得到的3种细菌可知，引发奶牛乳腺炎的主要致病菌可能是金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，此3种菌引起的乳腺炎占全部乳腺炎发病率的80%以上，这与以前有关报道相符[5，13，14]。从有关文献可知，奶牛乳腺炎病原菌的分布具有显著地域性，长春地区主要致病菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[15]。其中金黄色葡萄球菌为优势菌群，这与国内外有关报道相同[16]。因此，根据当地情况研究中西药对几种主要病原菌的体内外抑菌活性具有重要意义。

当今，在奶牛乳腺炎的治疗与防控中抗生素起了重要作用。但抗生素的长期使用，使得耐药菌株大量产生，以前常用抗生素不再具有强劲的抑菌作用。从本试验可知，诱发奶牛乳腺炎的3种主要致病菌对常用的青霉素类、红霉素类和庆大霉素类等抗生素均存在不同程度的耐药性，尤其长期使用青霉素类抗生素，使菌株产生了完全耐药性，这与牛场长期应用青霉素类药物治疗乳腺炎感染有关。因此，青霉素类药物在临床治疗奶牛乳腺炎方面疗效下降，基于此在治疗药物的选择方面应选择对3种菌株敏感性高的药物，如先锋霉素Ⅵ、环丙沙星等。

据文献报道，一些广谱抗生素的抗菌疗效较好，这与本试验结果中病原菌对氨基糖苷类抗生素庆大霉素及喹诺酮类抗生素环丙沙星药敏的结果相符合。但试验中最敏感的药物是先锋霉素Ⅵ，但根据临床上选择治疗药物的有关原则以及综合考虑药物对细菌的杀伤力、价格、耐药性、毒副作用及安全性等因素后，首选氨基糖苷类药物环丙沙星和喹诺酮类药物庆大霉素用于长春地区奶牛乳腺炎治疗。

但目前大量应用抗生素后，出现的耐药菌株数量增多，使防控奶牛乳腺炎难度增加，同时，对人类健康造成危害。为此，奶牛乳腺炎的治疗应采用交替用药，防止产生耐药菌株，严禁滥用抗生素，积极开拓创新治疗方法，减少抗生素后对人类健康的危害，防止耐药菌株的产生。由以上可知，在奶牛乳腺炎的治疗中，必须贯彻“预防为主”的方针，创建完善的奶牛饲养管理制度，改善牛舍环境卫生、训练挤奶员按规范程序操作和提高挤奶熟练度降低乳腺炎的发生率。

参考文献

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（责任编辑：刘昀）