灵芝L08对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及CD34表达的影响

周明霞，贺 靖，王洁琼，李 浩，施佳辰，安玉会

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450052)

灵芝L08对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及CD34表达的影响

周明霞，贺 靖，王洁琼，李 浩，施佳辰，安玉会

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450052)

目的探讨灵芝L08对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及其CD34蛋白表达的影响。方法培养肝癌SMMC-7721细胞，并用灵芝L08处理，MTT法测定细胞增殖情况，流式细胞术测定肝癌SMMC-7721细胞中CD34+肝癌SMMC-7721细胞数量，Western blot法测定CD34蛋白的水平。结果灵芝L08处理肝癌SMMC-7721细胞后，细胞增殖率及CD34+肝癌SMMC-7721细胞数量都有所降低，CD34+肝癌SMMC-7721细胞的CD34蛋白表达水平也降低(P<0.05)。结论灵芝L08能抑制CD34+肝癌细胞的增殖及CD34蛋白的表达。

灵芝；肝癌SMMC-7721细胞；CD34；细胞增殖

目前，肝癌总体治疗效果仍不理想，而导致其治疗困难、病死率高的主要原因就是治疗后肿瘤的复发和转移。L08是本实验室从灵芝中提取出的三萜类化合物，可诱导肿瘤细胞的凋亡，具有极大的抗肿瘤潜力[1]。本研究旨在观察灵芝L08对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及其CD34蛋白表达的影响，为灵芝L08应用于肝癌临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料L08(自制)；胎牛血清、DMEM高糖细胞培养基(美国Hyclone公司)；环磷酰胺(天津金世制药有限公司)；链霉素-青霉素双抗(美国Amresco公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；DMSO、MTT试剂(美国Sigma公司)；兔抗人CD34单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2细胞培养及药物处理肝癌SMMC-7721细胞采用体积分数10%胎牛血清及质量分数1%双抗的DMEM高糖培养基置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养，常规换液传代。取对数生长期细胞进行96孔铺板，待细胞过夜贴壁后，分别用不同浓度(100、300、500 mg·L-1)L08处理细胞24 h、48 h、72 h后MTT法测定细胞增殖情况。其中每个药物浓度设6个复孔。对照组为未经任何处理的细胞。

1.3MTT法测定肝癌SMMC-7721细胞增殖情况加药处理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721细胞培养基中每孔加入 20 μL(5 mg·mL-1)MTT试剂，37 ℃培养箱孵育4 h终止培养。用移液枪吸弃上层培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min充分融解结晶物。选择490 nm波长，在酶标仪上测定每个孔的光吸收度，记录结果，实验结果以细胞增殖抑制率表示。细胞增殖抑制率=[(1-处理组平均OD值)/对照组平均OD值]×100%。

1.4流式细胞仪测定CD34+肝癌SMMC-7721细胞数量分别收集加药处理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721细胞，加入PBS缓冲液及FITC标记的CD34抗体，轻轻吹打混匀，4 ℃避光孵育20 min。终止孵育后，采用PBS缓冲液洗细胞2次(2 000 r·min-1离心5 min)，加入500 μL PBS缓冲液混匀悬浮细胞后，采用流式细胞仪检测。

1.5Westernblot法测定CD34蛋白水平参考文献[2]中所用的本实验室前期研究方法进行CD34+肝癌SMMC-7721细胞中CD34蛋白表达。

2 结果

2.1灵芝L08对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制见表1。

表1 灵芝L08处理肝癌SMMC-7721细胞不同时间后的细胞增殖的抑制率 %

注：灵芝L08处理细胞后同一时间点各组抑制率两两比较，P<0.05

2.2灵芝L08对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制见表2。

注：灵芝L08处理细胞各组抑制率两两比较，P<0.05

2.3灵芝L08对CD34蛋白表达的影响见图1、表3。

图1 灵芝L08处理肝癌SMMC7721细胞后CD34蛋白的表达

A:空白对照组；B：灵芝L08 100 mg·L-1；C：灵芝L08 300 mg·L-1；D：灵芝L08 500 mg·L-1

表3 灵芝L08处理肝癌SMMC-7721细胞后CD34蛋白表达的灰度值

注：灵芝L08处理细胞各组抑制率两两比较，P<0.05

3 讨论

肝癌作为我国发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤之一，其治疗大都采取手术、化疗、放疗等方法，但总体的治疗效果并不好，主要的原因就是术后肿瘤的复发和转移[3]。肝癌组织中可能存在极少数具有干细胞特性的肿瘤细胞，这是肿瘤复发和转移的根源[4]。因此对肝癌干细胞的研究被认为是了解肝癌复发和转移的新途径之一。

目前，国内外对肝癌干细胞表面标志物的研究尚无明确定论。本实验室前期研究[5]发现，灵芝L08可抑制CD133+肝癌SMMC-7721细胞的增殖和CD133蛋白的表达，由于尚未发现肝癌干细胞特异的表面标志物，仅选择CD133作为生物标志物，尚不能说明灵芝L08可抑制肝癌干细胞的增殖。因此，本实验选择了以CD34作为另外一种标志物，进一步验证灵芝L08是否对肝癌干细胞产生了作用。CD34作为一种跨膜的表面糖蛋白，在肝癌组织中的表达主要与肿瘤新生血管有关，可以作为观察肝癌血管形成的一个标志物[6]。CD34在正常的肝窦内皮细胞中不表达，但可作为反映肝窦毛细血管化的有效指标[7]。

研究[8-9]表明，包括L08在内的灵芝中的三萜类成分可通过抑制蛋白激酶C活性同时激活有丝分裂活性蛋白激酶，使肿瘤细胞G2期延长，从而抑制肿瘤细胞的生长，最终起到抗肿瘤作用。本研究选择CD34+肝癌SMMC-7721细胞作为研究对象，探讨天然药物对其增殖的抑制作用。结果显示，灵芝L08可显著抑制CD34+肝癌SMMC-7721细胞的增殖及CD34蛋白的表达，且抑制率具有时间和浓度依从性。说明灵芝L08可有效抑制肝癌干细胞的增殖，这为天然药物应用于临床肝癌的治疗提供了理论依据。但本实验尚存在许多不足之处，首先，目前对三萜类化合物的分离纯化存在一定的困难，这就限制了对这些化合物的进一步研究和开发。其次，目前尚未明确肝癌干细胞的特异性表面标志物，所以仅用CD34作为标志物说服力较弱，尚需进一步完善实验从而得到更准确的结论。

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EffectofGanodermaL08ontheProliferationandCD34ExpressionofCD34+LiverCancerSMMC-7721Cells

Zhou Mingxia,He Jing,Wang Jieqiong,Li Hao,Shi Jiachen,An Yuhui

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BasicMedicalCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo explore the effect of ganoderma L08 on the proliferation and CD34 expression of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.MethodsLiver cancer SMMC-7721 cells were cultured and treated with ganoderma L08.Cell proliferation was detected by MTT method.The numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were measured by flow cytometry.The level of CD34 protein was measured by western blot method.ResultsAfter the treatment of ganoderma L08,the proliferation rate of liver cancer SMMC-7721 cells and numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were both decreased,and the level of CD34 protein in CD34+SMMC-7721 cells was decreased (P<0.05).ConclusionGanoderma L08 could inhibit the proliferation and CD34 expression in CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.

ganoderma; liver cancer SMMC-7721 cells; CD34; cell proliferation

安玉会(1952-)，男，教授，主要从事老年痴呆发生的分子机制及肿瘤干细胞方面的研究。E-mail：yuhuian@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.04.001

R735.7；R273

A

1673-5412(2014)04-0277-03

2014-01-07)