非小细胞肺癌患者外周血中多参数检测对诊断微转移的作用

郝 颖 付秀华 王立红 高俊珍

肺癌仍居全世界恶性肿瘤发病率和病死率的首位，手术切除仍是早期肺癌的首选方案[1]。随着外科手术技巧的大幅提升，手术风险和围手术期并发症的发生率得到了明显改善，但这并没有同等程度延长肺癌患者术后生存的时间。据报道，医院收治的可根治切除的Ⅰ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者5年生存率约为60%～70%，但仍有部分患者死于肺癌的转移或复发，生存率不容乐观[2-3]。

NSCLC的高病死率归因于肿瘤的转移和复发，部分患者在诊断初期已经发生了微转移。微转移指恶性肿瘤细胞在发展过程中，播散并存活于淋巴道、外周血、骨髓及各种器官中尚未形成显性转移灶，转移部位也无任何临床表现，常规影像学和病理学等检查均难以检测发现的一种微量转移特征。研究已发现多种与肺癌的发生发展密切相关的分子肿瘤标记物，包括细胞角蛋白家族、癌胚抗原、黏蛋白-1(MUC1)、EGFR、肺组织特异性X蛋白等。部分因子在肿瘤生物学行为中扮演了重要角色，有可能作为早期预测NSCLC患者术后是否转移或复发的重要指标。本研究通过检测NSCLC患者外周血中CK19、LunX、KS1/4的表达，探讨其与NSCLC微转移的关系。

材料与方法

一、病例资料

收集2010年2月至2012年5月内蒙古医科大学附属医院心胸外科A、B病区行肺叶切除加淋巴结清扫术的非小细胞肺癌患者52例。术前均通过支气管镜或经皮肺穿刺、痰脱落细胞学等检查病理证实为NSCLC，术前术后未经放、化疗、靶向等抗肿瘤治疗。选择同期行局部支气管扩张肺叶切除术、肺结核切除术、肺部错构瘤切除手术的患者20例作为对照组。

二、实验分组

入选患者分别于术后3个月、6个月和9个月复查胸部增强CT、腹部增强CT, 头颅MRI、全身同位素骨扫描或PET-CT等检查判断是否发生转移或复发。经随访后将52例患者再分为两组，将发生肿瘤局部复发或远处转移的病例命名为转移组，未发现肿瘤转移或复发的病例命名为无转移组。转移组：共18例，其中男性13例，女性5例，平均年龄60.9±8.3岁；鳞癌9例，腺癌7例，黏液表皮样癌1例，肺泡细胞癌1例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期8例。无转移组：共34例，其中男性28例，女性6例，平均年龄(59.1±8.3)岁；鳞癌14例，腺癌10例，支气管肺泡细胞癌4例，大细胞癌2例，混合型癌4例；Ⅰa～Ⅰb 期8例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期16例。对照组：男性14例，女性6例，平均年龄(50.1±2.2)岁。

三、实验方法

1.标本的采集及提取总RNA：采集肘静脉新鲜外周血2 ml放入EDTA抗凝管中，迅速放入-80 ℃冰箱中保存备用。弃去开始的1 ml避免上皮细胞的污染。取抗凝血2 ml，以离心半径8 cm，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，将4 ℃冰箱内预冷的红细胞裂解液以6︰1的比例加入到细胞沉淀中，吹打混匀后静置，以离心半径8 cm，1000 r/min，离心5 min，收集沉淀部分，生理盐水离心洗2次，收集沉淀，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA(北京天根生化科技公司，离心柱型，DP419)。

2. 反转录合成第一链cDNA：采用大连TAKARA公司PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser，按说明配制反应液体系1，冰上进行：5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、Total RNA 1 μg、余下为RNaseFree dH2O至总体积10 μl，42 ℃ 2 min后放入4 ℃保存；配制反应液体系2： 5×PrimeScript®Buffer 2 4 μl、PrimeScript®RT Enzyme Mix I 1 μl、RT primer Mix 1 μl、体系1 反应液 10 μl、RNaseFree dH2O至体系20 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃，反应结束后，cDNA放置-20 ℃保存备用。

3.荧光定量PCR反应：委托TAKARA生物技术公司完成引物序列的设计及合成，见表1。应用荧光定量PCR分析仪(美国ABI 7500fast)完成。按SYBR®Premix Ex Tap TM II (Perfect Real Time)(TAKARA Code: DRR081A)说明书完成反应体系的配制。

冰上配制PCR反应液：SYBR®Premix Ex TapTM Ⅱ(2×) 25 μl、PCR Forward Primer (10 μM)2.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μM) 2.0 μl、ROX Reference Dye II(50×)1.0 μl、cDNA 4.0 μl、d H2O 16.0 μl，95 ℃ 30 s灭活逆转录酶及预变性，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 CK19、LunX、KS1/4和GAPDH引物序列及扩增长度

四、统计学方法

结 果

经过随访，52例患者中发生转移或复发共18例，转移复发率34.6%(18/52)。

一、总RNA抽提结果

通过紫外分光光度仪检测RNA纯度，转移组OD268/280值在1.612～1.98之间，RNA浓度在100～1370 μg/ml之间；未转移组OD268/280值在1.732～2.1之间，RNA浓度在140～1020 μg/ml之间；良性病变组OD268/280值在1.800～2.0之间，RNA浓度在500～1410 μg/ml之间。经琼脂糖胶电泳，紫外线灯下观察可见2条清晰可见亮条带，分别代表28 s和18 s，28 s亮度、宽度约为18 s条带的2倍。

二、荧光定量PCR结果

根据扩增曲线记录目标基因的平均CT值，即基因成指数扩增起始时所经历的循环数。本实验采用2-△△CT方法比较组织中各目标基因的表达差异,当扩增效率接近1时，可用2-△Ct表示目的基因在组织中的相对表达量(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)，ΔCt值与基因的表达量呈反比关系，ΔCt越低，提示基因表达量越高。GAPDH的CT值在15～25之间，目的基因产物的CT值在15～35之间，见图1～8。

三、NSCLC转移组、无转移组与肺良性病变外周血标本中三种因子表达比较

外周血中CK19mRNA的ΔCt值在转移组、无转移组及对照组呈递增关系，说明其CK19mRNA的表达量呈递减趋势，转移组中CK19mRNA的表达量高于无转移组及对照组，差异有统计学意义(P=0.038)；这种关系也同样体现在LunX mRNA上，转移组外周血中LunX mRNA的表达量高于无转移组及对照组，差异有统计学意义(P=0.034)；KS1/4 mRNA的表达也同样是这种趋势，但P值并无统计学意义，见表2。

四、转移组患者外周血中不同因子的表达差异

我们分别对转移组外周血中三种因子的表达量做了比较，结果显示LunXmRNA表达量最高，KS1/4mRNA 其次，CK19mRNA表达最低，差异具有统计学意义(P=0.004)，见表2。

表2 三组患者外周血标本三种因子ΔCt值表达比较

图1 GAPDH熔解曲线 图2 CK19熔解曲线 图3 LunX熔解曲线 图4 KS1/4熔解曲线

图5 GAPDH扩增曲线 图6 CK19扩增曲线 图7 LunX扩增曲线 图8 KS1/4扩增曲线

讨 论

肿瘤的发生发展是一个复杂的生物过程，微转移只是其中的一个阶段，多种分子生物共同参与其发生和发展。肿瘤细胞从原发病灶脱落后，随血运或淋巴管播散到新环境，但并非一定形成转移灶。动物实验表明经静脉注射癌细胞后而只有0.01%最终形成了转移灶，绝大部分进入血液循环的肿瘤细胞被机体免疫吞噬清除，循环内必须有大量肿瘤细胞播散后方有机会形成远处转移[4]。不可避免的是仍有部分早期癌症患者要遭受肿瘤细胞的脉管侵犯，导致肿瘤的远处转移。张静渊等[5]在研究中发现，肿瘤细胞的脉管内侵犯与肿瘤的胸膜浸润、淋巴结转移及远处转移密切相关(P<0.05)，但与年龄、肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05)，提示肿瘤的脉管侵犯预示着远处转移的发生，较传统的TNM分期能更早一步准确评估预后，而肿瘤脉管侵犯常与外周血中CK19mRNA表达呈正相关。

CK19是被广泛研究并公认的肿瘤标记物之一，其在肺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌、喉癌中的研究最多[6-10]。上皮细胞的过表达是肿瘤生物活动的主要表现形式，CK19为上皮细胞家族中的敏感性最高的片段，被认为与肿瘤的发生密切相关，血清检测CK19片段诊断非小细胞肺癌的特异性达87%。Ge等[11]认为CK19 mRNA在NSCLC淋巴结中阳性表达可作为预测预后的独立指标，并可作为肺癌临床分期的补充。本研究的受试对象经术后随访发现肿瘤转移或复发发生率为34.6%(18/52)。发生转移组患者外周血中CK19mRNA的表达与未发生转移组的差异有统计学意义，转移组LunX mRNA在外周血的表达也明显高于无转移组，与CK19mRNA的表达基本一致，且两组中CK19mRNA、LunX mRNA的表达均明显高于对照组，差异有统计学意义。说明CK19和LunX与NSCLC转移关系密切，部分NSCLC患者其实在手术治疗前已经发生肿瘤细胞血液浸润，CK19和LunX能在一定程度上预测转移的发生。朱广迎等[12]通过6～16个月的短期随访发现LunX基因表达阳性组复发和转移率为52%，阴性组复发和转移率仅为18%。而Yu等[13]认为LunX基因不仅能辅助诊断非小细胞肺癌，且对病理分型有指向性意义。牛瑞等[14]认为患者的生存时间与LunX mRNA的表达有相关性，这与我们的研究结果一致。CK19、LunX阳性表达一定程度上提示肿瘤负荷增加，预示微转移的存在，术后发生转移或复发的风险增加，可以作为诊断NSCLC微转移的指标。

上皮癌相关基因(epithelial carcinoma-associated gene, KS1/4)是一种上皮细胞表面抗原，为超级免疫球蛋白家族中的黏着蛋白的一种[15-16]，因能结合多种不同单克隆抗体而被识别。KS1/4横跨于细胞膜表面，在细胞增殖、成形过程中起粘连及细胞核信号传导作用[17-18]。 KS1/4最初发现表达于结肠癌、胃肠癌、胰腺癌等上皮细胞内，后来许多研究在肺癌、前列腺癌、肝癌细胞中也检测到KS1/4的阳性表达，故称其为上皮癌相关基因。目前，KS1/4已经被认为是一种癌相关蛋白因子，通过癌细胞的跨膜蛋白水解[17, 19]和在干细胞信号转导中发挥作用[20-22]。Mitas等[23]通过RT-PCR对NSCLC患者淋巴结LunX, KS1/4, CEA, CK19和MUC1做了检测，首次提出KS1/4为诊断NSCLC特异性最高的标记物。Wallace等[24]采用RT-PCR检测NSCLC患者淋巴结中LunX、MUCl。KS1/4, CEA, CK19 及 PSE的表达结果显示，KS1/4的阳性表达率为25%，被认为是发现肿瘤微转移最特异的基因。本实验检测外周血中KS1/4mRNA的表达发现，其在三组中的表达差异无统计学意义。我们推论KS1/4可能在肿瘤发生早期有一定生物学行为，尤其在淋巴结微转移中发挥了作用，其在外周血的检测诊断微转移意义需重新定位。KS1/4可能在外周血内表达量低或不表达，或受其他因素影响而表达量降低，如是否存在竞争抑制等等，导致外周血中检测阳性率低。

本研究还对转移组内因子间的表达差异对了对比，结果显示：转移组外周血中LunXmRNA的表达最高，KS1/4mRNA其次，CK19mRNA的表达最低，差异有统计学意义(P=0.004)，提示LunX在外周血检测诊断微转移的特异性较KS1/4、CK19高。Mitas等[23]在实验中应用实时定量 PCR 技术检测 24 例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者外周血LUNX，MUC1, KS1/4, CEA，CK19 及 PSE 的表达，其中LUNX 阳性表达率最高, 为 42%，认为其特异性表达与肺癌的发生关系密切。这与我们的实验结果符合，更进一步证实了我们的结论。

肿瘤细胞最终是否形成转移与癌细胞的自身生物学行为、机体免疫及营养状态、术式的选择、淋巴结清扫情况、局部微循环等多因素共同参与有关。目前临床应用TNM 分期为NSCLC患者做预后评价，微转移的存在为分子分期(TNMB)提供了有力的依据。综上所述，虽然本研究样本例数偏少，但还是得到了与国外关于NSCLC微转移的多项研究相似的结论，因此，我们认为CK19、LunX可以作为预测NSCLC转移或复发的指标，辅助诊断NSCLC微转移，其中LunX的敏感性略显优势。

参 考 文 献

1 钱桂生. 肺癌不同病理类型发病率的变化情况及原因[J/CD]. 中华肺部疾病杂志：电子版，2011，4(1)：1-6.

2 Matsuoka K, Sumitomo S, Nakashima N, et al. Prognostic value of carcinoembryonic antigen and CYFRA21-1 in patients with pathological stage I non-small cell lung cancer[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2007, 32(3): 435-439.

3 Maruyama R, Sugio K, Mitsudomi T, et al. Relationship between early recurrence and micrometastases in the lymph nodes of patients with stage I non-small-cell lung cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1997, 114(4): 535-543.

4 Mitas M, Mikhitarian K, Walters C, et al. Quantitative real-time RT-PCR detection of breast cancer micrometastasis using a multigene marker panel[J]. Int J Cancer, 2001, 93(2): 162-171.

5 张静渊, 尹 荣, 徐新宇. 非小细胞肺癌的脉管内侵犯与微转移、微血管密度关系的研究[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2013, (07): 887-891.

6 陈玉敏, 王金林, 师锁江, 等. 胃癌患者外周血中CK-19的表达及其临床意义[J]. 中国医药导报, 2013, 10(14): 4-6, 10.

7 吴 蔚, 胡国华, 康苧心, 等. CK19和EGFR mRNA在喉癌动物模型外周血中的表达及其与淋巴转移关系[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2011, 25(11): 501-505.

8 余 辉, 黄秀英, 王 欣, 等. 非小细胞肺癌患者外周血CK19 mRNA检测临床意义的探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2011, 18(13): 1024-1026.

9 孟庆翔, 谢景华, 高雄辉, 等. 喉癌患者治疗前后外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达及临床意义[J]. 中国癌症防治杂志, 2011, 18(4): 302-305.

10 张 俊, 曾照芳. CK-19 mRNA对乳腺癌的微转移诊断价值的Meta分析[J]. 激光杂志, 2012, (02): 77-78.

11 Ge MJ, Wu QC, Wang M, et al. Detection of disseminated lung cancer cells in regional lymph nodes by assay of CK19 reverse transcriptase polymerase chain reaction and its clinical significance[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131(10): 662-668.

12 朱广迎, 陈 杰. 肺癌患者三种微转移标志物临床意义的比较研究[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 2003, 12 (3): 41-45.

13 Yu H, Huang X, Zhu Z, et al. Significance of combined detection of LunX mRNA and tumor markers in diagnosis of lung carcinoma[J]. CHINESE J CANCER RES, 2014, 26(1): 89-94.

14 牛 瑞, 刘 波, 邵明举, 等. 非小细胞肺癌区域淋巴结中肺组织特异性基因的表达与预后的关系[J]. 山东大学学报(医学版), 2007, 45 (9): 882-885.

15 Cavallaro U, Christofori G. Cell adhesion and signalling by cadherins and Ig-CAMs in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2004, 4(2): 118-132.

16 Litvinov SV, Bakker HA, Gourevitch MM, et al. Evidence for a role of the epithelial glycoprotein 40 (Ep-CAM) in epithelial cell-cell adhesion[J]. Cell Adhes Commun, 1994, 2(5): 417-428.

17 Maetzel D, Denzel S, Mack B, et al. Nuclear signalling by tumour-associated antigen EpCAM[J]. Nat Cell Biol， 2009， 11(2): 162-171.

18 Carpenter G, Red BM. EpCAM: another surface-to-nucleus missile[J]. Cancer Cell, 2009, 15(3): 165-166.

19 Trzpis M, Bremer E, McLaughlin PM, et al. EpCAM in morphogenesis[J]. Front Biosci, 2008, 13: 5050-5055.

20 Gonzalez B, Denzel S, Mack B, et al. EpCAM is involved in maintenance of the murine embryonic stem cell phenotype[J]. Stem Cells, 2009, 27(8): 1782-1791.

21 Ng VY, Ang SN, Chan JX, et al. Characterization of epithelial cell adhesion molecule as a surface marker on undifferentiated human embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2010, 28(1): 29-35.

22 Munz M, Baeuerle PA, Gires O. The emerging role of EpCAM in cancer and stem cell signaling[J]. Cancer Res, 2009, 69(14): 5627-5629.

23 Mitas M, Cole DJ, Hoover L, et al. Real-time reverse transcription-PCR detects KS1/4 mRNA in mediastinal lymph nodes from patients with non-small cell lung cancer[J]. Clin Chem, 2003, 49(2): 312-315.

24 Wallace MB, Block MI, Gillanders W, et al. Accurate molecular detection of non-small cell lung cancer metastases in mediastinal lymph nodes sampled by endoscopic ultrasound-guided needle aspiration[J]. Chest, 2005, 127(2): 430-437.