HPLC法测定桔梗药材中桔梗皂苷D的含量

★ 洪玮 罗娟敏 郭磊 樊海燕 索卫国 黄卫东 蔡继宝

(江西中烟工业有限责任公司技术研发中心 南昌 330096)

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，其味苦、辛，性平，归肺经，有开宣肺气，祛痰排脓之功效[1]。临床上用于治疗咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛，音哑，肺痈吐痰，疮疡脓成不溃等症[2]。主要化学成分为齐墩果酸型五环三萜皂苷，桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D[3]等，其他尚含有黄酮、聚炔、甾体、酚酸、脂肪酸等类型的化合物。现代研究表明，桔梗的主要活性成分为桔梗皂苷类成分，具有祛痰、抗炎、降低毛细血管通透性、抑制佐剂性关节炎[4]、以及松弛肠道平滑肌、抗肿瘤[5]等多方面的生物活性。本实验通过HPLC建立了桔梗中桔梗皂苷D含量测定的方法。

1 材料与仪器

Agilent 1100高效液相色谱系统，配DAD检测器(Agilent公司，美国)，Milli-Q超纯水仪(Millipore公司，美国)、Phenomenex Luna C18色谱柱、BSA124S天平(Sartorius)。

乙腈(色谱纯，TEDIA)、磷酸(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)、超纯水、桔梗皂苷D标准品(中国药品生物制品检定所111851-201204)、桔梗标准药材(中国药品生物制品检定所121028-201210)、桔梗药材分别购于某市的各大药店及药材市场，经江西中医药大学张文惠教授鉴定均为桔梗药材。

2 实验方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1%磷酸溶液，流动相B：乙腈，按表1进行梯度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量10μL；检测波长为210nm。

表1 梯度洗脱程序

2.2 供试品溶液的制备 精密称定干燥桔梗粉末(过三号筛)适量，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超声30min，滤过；滤渣置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超声30min，滤过；合并续滤液，于水浴中蒸干至50mL以下，用甲醇定容至50mL，续滤液过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取桔梗皂苷D对照品适量，用甲醇溶解并稀释成0.24mg/mL的溶液，即得。

2.4 线性关系的考察 分别量取对照品储备液5，2，1，0.5mL，分置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过；精密吸取上述溶液及储备液各10L注入色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)对溶液浓度(X)进行线性回归。结果表明桔梗皂苷D在0.06-2.4μg范围内，峰面积具有良好的线性关系，其回归方程为：Y=2984X-3.5993，r=0.9999色谱图见图1-2。

图1 桔梗皂苷D对照品的色谱图

图2 桔梗提取液的色谱图

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μL，在2.1项色谱条件下，连续进样6次，得到桔梗皂苷D的峰面积，其RSD为0.42%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在2.1项色谱条件下，分别在0，3，6，9，12，24h记录桔梗皂苷D的峰面积，其RSD为0.62%，说明样品溶液在24h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取同一批样品5份，置具塞锥形瓶中，精密称定，按2.2项供试品溶液的制备方法下制备，在2.1项色谱条件下测定，样品中桔梗皂苷D的平均含量为2.089mg/g，RSD为3.46%，表明方法的重复性较好。

2.8 加样回收试验 精密称取已知含量的同一批样品6份，置具塞锥形瓶中，加入一定量的对照品，按2.2项供试品溶液的制备方法制备样品，依照2.1项色谱条件测定，桔梗皂苷D的平均回收率为100.09%，RSD为1.73%，结果见表5。

表5 桔梗皂苷D的加样回收试验结果

3 结果

分别测定了13个桔梗药材样品中桔梗皂苷D的含量，结果见表6。

表6 13个桔梗药材样品中桔梗皂苷D的含量

4 讨论

4.1 考察了不同提取方法(超声提取、加热回流提取、索式提取)对桔梗皂苷D提取率的影响，结果表明，超声提取与加热回流提取的桔梗皂苷D的含量相当，且大于索氏提取得到的量，由于超声方法比较简便，因此采用超声提取作为桔梗皂苷D的提取工艺。

4.2 考察了不同提取溶剂(水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇)对桔梗皂苷D提取率的影响，结果表明，以50%和75%甲醇溶液作为提取溶剂所制得的桔梗皂苷D含量最高且相当，但使用50%甲醇溶液更经济，因此本实验选定甲醇含量为50%。

4.3 考察了不同溶剂用量(20、30、50、65mL)对桔梗皂苷D提取率的影响，结果表明，溶剂用量为20mL得到的桔梗皂苷D含量较少，溶剂用量为30、50、65mL得到的桔梗皂苷D含量相差不大，因此选定溶剂用量为30mL。

4.4 考察了不同提取时间(20、30、40、50min)对桔梗皂苷D提取率的影响，结果表明，超声20min得到的桔梗皂苷D含量较少，超声30、40、50min得到的桔梗皂苷D含量相差不大，因此选定超声时间为30min。

4.5 考察了不同提取次数(1次、2次、3次)对桔梗皂苷D提取率的影响，结果表明，初次提取的桔梗皂苷D含量为4.01mg/g，第二次提取后桔梗皂苷D的含量占2次总含量的13.20%，第三次桔梗皂苷D的含量占3次总含量的3.55%，因此，采用二次可基本提取完，本实验选择二次超声提取。

4.6 实验结果表明，所收集的桔梗药材均符合2010版中国药典桔梗项下以桔梗皂苷D(C57H92O28)计不得少于0.1%的规定。本法建立的测定桔梗中桔梗皂苷D含量的方法简便，重复性好，可用于桔梗药材的质量评价。

[1]国家药典委员会.中国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:259-260.

[2]武博,刘萍.桔梗的现代研究进展[J].中国药物应用与监测,2008,05(2):48-50.

[3]郭文杰,许旭东,魏建和,等.桔梗中三萜皂苷类化学成分研究进展[J].中国药学杂志,2008,43(11):801-804.

[4]吴文君,单提昆,何嘉凝,等.桔梗皂苷化学结构及药理研究进展[J].吉林医药学院学报,2012,33(3):176-178.

[5]尹若熙,俞腾飞,李中燕,等.桔梗的药理学研究进展[J].中国医药科学,2012,02(19):36-37,62.