星点设计-效应面法优化菊花提取工艺

★ 邵考珍 谭梅英 詹利之

(1.广东省佛山市南海区第七人民医院 佛山 528248；2.广东省第二中医院 广州 510095；3.广州中医药大学青蒿研究中心 广州 510405)

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。9-11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干。药材按产地和加工方法不同，分为“亳菊”、“滁菊”、“贡菊”、“杭菊”。菊花作为药食两用植物，具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效；用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等症[1]。现代药理表明，菊花总黄酮具有降血压，扩张冠状动脉，防止冠脉粥样硬化等作用，临床上用于治疗高血压和冠心病[2]。本实验采用星点设计-效应面法优化菊花提取工艺，研究各因素与菊花总黄酮之间的交互关系，得到拟合度优良的回归方程，实现对菊花提取工艺的优化。

1 仪器与试药

UV-9100紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；AE-240电子天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司)。

菊花(购于广州致信药业有限公司，批号121107)，经鉴定为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，为正品；芦丁对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号100080-200306)；95%乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定[3-5]

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25.21mg，置50mL量瓶中，加乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取25mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL含芦丁对照品0.2521mg)。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1，2，3，4，5，6mL，分别置25mL量瓶中，各加50%乙醇至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录ⅤA)，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.01156C+0.0048(r=0.9993)。结果表明芦丁在10.084-60.504μg/mL浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.3 测定法 精密量取提取液(表2试验设计所得)1.0mL，置10mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1mL，置25mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50%乙醇至6mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算总黄酮的收率，即得。

2.2 星点设计-效应面法优化菊花提取工艺

2.2.1 试验设计方案 综合单因素试验结果，采用回流提取法，固定提取温度为80℃，提取次数为2次，考察乙醇浓度、溶剂体积与提取时间3个因素。根据星点设计的原理，每因素设5个水平，用代码值-α、-1、0、1、α来表示(3个因素星点设计的α=1.682)。因素水平见表1，实验设计和结果见表2。

表1 菊花总黄酮提取工艺因素水平

表2 菊花总黄酮提取工艺设计方案与实验结果

2.2.2 模型的建立及显著性检验 利用Design Expert，对各因素进行多元回归拟合，并以ANOVA分析效应面的回归参数。由表3可知，各因素的一次项、二次项都达到极显著水平(P<0.01)。菊花总黄酮提取率对乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)和提取时间(C)的二次多项回归模型：

Y=-3.71102+0.092298A+0.56765B+0.058736C+3.12500×10-4AB-6.25000×10-5AC+1.45833×10-4BC-6.63886×10-4A2-0.022784B2-3.50058×10-4C2

式中，Y-总黄酮提取率(%)；A、B、C-分别代表乙醇浓度、乙醇用量、提取时间。该方程的相关系数r=0.9871，模型达到极显著水平(P<0.01)，表明方程对试验拟合较好，可以对不同条件下菊花总黄酮提取率的进行预测。

表3 二次回归方程方差分析

2.2.3 提取工艺优化与验证 采用Design-Expert软件，作出相应的曲面图和等高线图，如图1～6所示。结合二次回归模型的数学分析结果，菊花总黄酮的最佳提取工艺参数：乙醇浓度为68.83%，乙醇用量为13.19倍，提取时间为80.46min。总黄酮理论提取率为5.5721%。对最佳工艺条件进行验证实验，结果表明，菊花总黄酮平均提取率为5.4935%，RSD为1.83%(n=5)，表明所建立的回归模型具有良好的预测性，所选的工艺条件重现性好。

图1 乙醇浓度与乙醇用量对总黄酮提取率影响等高线图

图2 乙醇浓度与乙醇用量对总黄酮提取率影响3D响应面图

图3 乙醇浓度与提取时间对总黄酮提取率影响等高线图

图4 乙醇浓度与提取时间对总黄酮提取率影响3D响应面图

图6 提取时间与乙醇用量对总黄酮提取率影响3D响应面图

3 讨论

目前，国内学者多采用正交设计或均匀设计法优化菊花的提取工艺[3-7]，即用线性数学模型进行拟合，试验次数虽少，但精度不够，预测性较差。星点设计是国外常用的实验设计方法。该法采用非线性数学模型拟合，复相关系数较高，在中心点进行重复性实验以提高实验精度，预测值更接近真实值。

本文采用星点设计-效应面法优选菊花的提取工艺，最终确定其最佳提取条件。在最佳条件下，实测值与预测值比较吻合，相对偏差较小。本研究为星点设计-效应面法应用于中药提取工艺的优化提供实验依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：292.

[2]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海：上海科技出版社，1977：2008.

[3]时岩鹏，刘伟，姚庆强，等.菊花总黄酮提取工艺研究[J].中草药，2007，38(增刊)：141-142.

[4]王加文，洪建华，雷志强.菊花总黄酮提取工艺研究[J].河北化工，2010，33(12)：19-25.

[5]林砚淋，王志良，陈婷，等.菊花叶中总黄酮提取及对自由基清除作用的研究[J].时珍国医国药，2010，21(11)：2 993-2 996.

[6]廖彩震，陈培胜，张文惠，等.正交试验优选菊花配方颗粒的提取工艺[J].世界中西医结合杂志，2010，5(10)：858-860.

[7]李朋伟，张景亚，仝艳，等.菊花多糖提取工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40(6)：3 586-3 587.