清咽口含片水提工艺的研究*

★ 韩越 刘顺 范玲 周琴妹

(南京中医药大学第一附属医院 南京 210029)

清咽口含片组方是江苏省中医院临床经验方，由白毛夏枯草、射干、玄参等六味中药组成，具有疏风解毒、宣肺利咽、凉血祛癣、化痰散结之功效，临床上用于治疗急慢性咽炎。方中白毛夏枯草为君药，其主要有效成分为乙酰哈巴苷。[1]本研究采用单因素考察和正交试验相结合的方法，以浸出物及乙酰哈巴苷转移率为指标，优选出最佳水提工艺条件。结果表明，该方法稳定、可行，适用于工业化大生产。

1 材料

1.1 仪器与设备 Waters e2695型高效液相色谱仪，2998PDA检测器(美国Waters公司)；BP-211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；101-1A型数显电热鼓风干燥箱(上海沪南科学仪器联营厂)。

1.2 试药 白毛夏枯草等饮片均购于安徽协和成药业饮片有限公司，均符合2010版《中华人民共和国药典》(一部)要求；乙酰哈巴苷对照品购自南京泽朗医药有限公司(批号：ZL20110303YX，含量98%)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法和结果

2.1 浸泡时间的考察 根据《中华人民共和国药典》(2010年版)附录XA浸出物测定的方法，[2]分别考察0.5、1、1.5小时3个不同浸泡水平下的水溶性浸出物含量，浸出物结果如表1所示。

表1 浸出物含量测定结果

由实验结果可知，浸出物含量随着浸泡时间的增加而增加，在浸泡时间1小时的时候溶剂浓度已经达到饱和，继续增加浸泡时间对浸出物含量的增加已经没有意义，故选定浸泡时间为1小时。

2.2 试验设计 选定提取次数(A)、加水量(B)、提取时间(C)为考察因素，每个因素各设3个水平，以乙酰哈巴苷转移率作为考察指标，[3]选用L9(34)正交表设计试验。见表2。

2.3 乙酰哈巴苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱： Hedera-ODS-2 C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 um)；流动相：乙腈(A)-水：0～35分钟，9%A；35～40分钟，9%～90% A；40～50分钟，90% A；50～55分钟，90%～9%A；55～60分钟，9%A。流速：1 mL/分；柱温：30 ℃；检测波长：207 nm。乙酰哈巴苷能得到较好分离，分离度>1.5，且阴性无干扰。理论塔板数按乙酰哈巴苷峰计算不低于2 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取乙酰哈巴苷对照品9.10 mg，置于25 mL的容量瓶中，甲醇定容；精密量取1 mL置于5 mL的量瓶中，甲醇定容，摇匀即得(乙酰哈巴苷含量0.0728mg/mL)。

2.3.3 标准曲线绘制 精密吸取上述对照品溶液3、5、10、15、25、35 μL进样，测定峰面积值，以乙酰哈巴苷的进样量(X，μg)对其峰面积值(Y)进行线性回归，回归方程为：Y=506529X+20502，r=0.9999，结果表明：在0.2184～2.548μg范围内，峰面积值与乙酰哈巴苷进样量有良好的线性关系。

2.3.4 供试品及阴性样品溶液的制备[4]按处方比例称取白毛夏枯草等饮片35 g共9份，合并醇提饮片射干药渣，回流提取，滤过，合并滤液，精密吸取上述提取液5 mL置25 mL的容量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得，色谱图如图2、3所示。

图1 对照品色谱图

图2 供试品色谱图

图3 阴性样品色谱图

2.3.5 含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定水提液中乙酰哈巴苷的含量，计算其转移率，结果见表2、3。

表2 水提工艺因素水平表

表3 正交试验数据及极差分析结果

表4 乙酰哈巴苷转移率方差分析表

由表3可以看出，三因素的主次顺序为B、A、C，最佳提取工艺条件为A3B2C2；由表4可以看出，A、B因素对乙酰哈巴苷转移率有显著性影响(P<0.05)，C因素对乙酰哈巴苷转移率无显著性影响(P>0.05)。从节能、节时的角度考虑，确定最佳提取工艺为A3B2C1，即10倍量的水提取3次，每次1小时。

结合单因素考察结果，水提的最佳工艺为10倍量的水，浸泡1小时后，提取3次，每次1 小时。

2.4 水提最佳工艺验证

按处方比例称取白毛夏枯草等饮片3份，按水提单因素及正交实验所选择的最佳工艺条件进行3次重复实验，测定提取液中乙酰哈巴苷转移率(%)分别为：80.81、82.97、81.34，RSD=1.27%。结果表明优选出的工艺稳定性良好。

3 讨论

白毛夏枯草中乙酰哈巴苷最大吸收波长为197nm，为紫外末端吸收。[3]若采用等度法测定，干扰很大，峰形差，分离度也不好；本研究采用梯度法测定，峰形较好，分离度也能达到要求。

白毛夏枯草等五味饮片水提试验表明：提取次数对乙酰哈巴苷的转移率有显著性影响。在优选水提工艺中其它参数不变的情况下，提取3次和4次的乙酰哈巴苷转移率(%)分别为82.05、83.41，结果差异也不大，所以从生产成本考虑，将水提的提取次数定为3次。

[1]孙建新，李志浩.白毛夏枯草的研究进展[J].中医药导报，2010，16(3)：102-104.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010，附录XA：附录62.

[3]岳党昆，丁广治.HPLC测定筋骨草中乙酰哈巴苷的含量[J].中国中药杂志，2006，31(4)：289-290.

[4]袁淑婧，范玲，周琴妹.清咽口含片醇沉工艺优选[J].中国实验方剂学，2012，18(21)：25-27.