长期缺氧对婴幼儿肠道菌群代谢的影响

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(第三军医大学新桥医院心血管外科，重庆 400037)

马尿酸是甲苯、苯甲酸等的代谢产物，分子式为C9H9NO3,分子量179。饮食中的芳香族化合物由肠道微生物代谢成苯甲酸，随后肝肾结合苯甲酸和甘氨酸，形成马尿酸。尿液中代谢物的差异反应出肠道微生物代谢变化引起的整体结果，尽管也可能包括宿主代谢途径的变化。肠道环境的改变导致了马尿酸的减少[1-2]。为了研究长期低氧暴露对婴幼儿体内肠道菌群代谢的影响，我院采用核磁共振波谱仪(1H-NMR)检测紫绀型先天性心脏病婴幼儿和同龄健康儿童尿液马尿酸含量，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 临床资料

本研究经过第三军医大学附属新桥医院伦理委员会批准。将法洛四联症患儿10例设为缺氧组，其中男6例，女4例，年龄21～25个月，体质量7.5～11 kg，动脉血氧饱和度70%～86%。10例健康儿童作为对照组，男6例，女4例，年龄20～24个月，体质量12～15 kg，动脉血氧饱和度100%。采集清晨空腹尿液,3 000 r/min离心10 min后，置于-20 °C冰箱保存待测。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 仪器：德国Bruker Avance Ⅲ 600 MHz

超导核磁共振波谱仪，配TCI三共振反式超低温探头。离心机德国Eppendorf MiniSpin Plus。试剂：重水美国NORELL公司,99.8%;三甲基硅丙磺酸钠(DSS)为青岛腾龙微波公司进口分装；K2HPO4,NaH2PO4为广东光华化学厂有限公司产品。

1.2.2 一维1H-NMR波谱 配制尿液样品时，尿样12 000 r/min,离心10 min,取500 μl尿样，加入250 μl磷酸缓冲液(0.1 mol/L K2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4，30%D2O)混合，以消除因pH变化所引起谱图化学位移漂移，静置10 min,离心10 min后,取上层液500 μl移入5 mm NMR样品管。加入50 μl D2O(用于锁场)，振荡混匀。采用预饱和的1D CPMG脉冲序列。谱宽20 ppm,采用600.13 MHz的质子共振频率，298 K的实验温度。采样时间为0.1 s，弛豫延迟时间为2 s。采样点数32 K，累加次数64次，谱仪偏置设在水峰的位置，自由感应衰减信号经过填0为64 K点之后，再加1.00 Hz的线宽因子，经傅里叶变换转换为NMR谱图。每张NMR谱记录48个FID，采用线宽为1.0 Hz的指数窗函数，进行傅立叶变换。参照DSS作为化学位移内标,对1H-NMR谱的化学位移进行定标。磁共振波谱仪样品管内DSS浓度40 μg/mL。1维氢谱重要采样参数：CPMG:TD=32 K，SW=20 ppm,NS=64,DS=4,D1=2 s,D2O=350 μs,L4=100(2nt=70 ms)。其余采样参数如90度脉宽值(P1)及其所对应的功率值(PL1)，压水功率值(PL9)，压水频率(O1)，增益值(RG)根据具体样品进行测定，P1值以接近10 μs为佳。重要处理参数：SI=64 K,WDW EM,LB=1 Hz,PH_mod pk,Tdeff=0。

1.3 数据处理

马尿酸定量峰的选择:采用磁共振波谱仪进行定量时应首先对样品的各个质子峰进行归属，明确每个质子峰所对应的质子数。选7.82 ppm含2个氢质子的双峰用于定量。测定选定峰与DSS面积的相对比值，计算含量。

马尿酸样品的绝对重量(Wx)由下式求得：Wx=Ws×(Ax/As)×(E/Es)(Ws为内标物重量；Ax为样品峰面积；As为内标物峰面积；E为样品在该化学位移处的质子当量，即E=样品分子量/产生该共振峰的基团中的质子数；Es为内标物在该化学位移处的质子当量，即Es=内标物分子量/产生该共振峰的基团中的质子数。)

1．4 统计学方法

采用SSPS 13.0软件，进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

患儿与健康儿童尿液1H-NMR谱图见图1。患儿与健康儿童尿液马尿酸浓度分别为(47.15±32.88) mg/L，(346.69±13.55) mg/L，P=0.002。

图1患儿与健康儿童尿液1H-NMR谱图(红色：健康儿童；蓝色：长期缺氧儿童)

3 讨论

肠道微生态系统是机体最庞大、最重要的微生态系统。肠道微生态系统经常处于动态平衡稳定之中，同时又容易受到肠道内外许多因素影响,导致肠道微生态紊乱。年龄越小，特别是婴幼儿肠道微生态平衡稳定非常脆弱，越容易受到各种因素影响，导致严重的肠道微生态紊乱。

肠道微生菌在胆红质代谢的肠肝循环中起到十分重要的作用。当肠道微生态平衡稳定，胆红质代谢的肠肝循环得以正常进行；相反，若肠道微生态紊乱，肠道菌丛发生变化就会干扰胆红质的肠肝循环，影响肝脏的胆红质代谢，从而影响到肝脏功能。此外，肠道菌群是否平衡稳定对肠道上皮细胞功能也有明显的影响。肠壁的完整和肠上皮细胞的正常，对肝脏的营养、物质代谢无疑起到良好作用。相反，则肝脏、肝功会受到损伤或加重已发生的肝损害及肝功能障碍[3]。人体维生素K主要由肠道正常菌群产生和食物供给，其中大多数维生素由肠道菌合成。肠道菌群紊乱和破坏可引起维生素K依赖性因子缺乏，因而表明肠道正常菌群对维生素K的产生具有重要的作用,是人体维生素K的主要来源[4]。肠道微生物组学对健康人的重要性，提供新的理解，能够描绘种属、个体和群体之间的微生物组学变化。已经明确了肠道微生物组学在许多疾病病理发展过程中的重要性，如肥胖、心血管疾病以及炎性肠道疾病。

自从Liebig[5]在1829年第一次确定尿液里的马尿酸以来，就一直在研究马尿酸的起源。在20世纪早期确定人类的马尿酸是苯甲酸和甘氨酸结合的产物[6]，即由肠道微生物将饮食中的芳香族化合物代谢成苯甲酸，随后肝肾结合苯甲酸和甘氨酸，形成马尿酸。后期的研究揭示，这是通过一种在肝脏和肾脏线粒体中的苯甲酸辅酶A结合而成的[7-9]。动物实验证实，尿液马尿酸排泄由肠道微生物组成调节[10-11]。肠道菌群直接分解苯甲酸产生马尿酸也是其来源之一[12]。关于人尿液中排泄浓度，邱晓岩等[13]检测33名职工尿中马尿酸值的变化范围为0～1 250.75 mg/L，呈正态分布，平均值为479.54 mg/L,标准差为257.07 mg/L。本次研究健康儿童尿液马尿酸浓度为(346.69±13.55) mg/L，与成人接近。

近年来对健康人群的研究，更深入地了解了肠道细菌对人体代谢表型的巨大影响[14]。Li等[14]发现梭状芽孢杆菌和马尿酸水平呈正相关，可能与本研究中马尿酸减少有关。与长期缺氧有关的尿液代谢研究分析了肠道微生物菌群的分子机制，提示将是更宽广的研究方向。尿液代谢物水平受到肠道微生物差异的显著影响，即肠道细菌代谢、宿主和细菌分享代谢(共生代谢)产生特异的代谢物[15]。这样的代谢物可以用作微生物代谢反应的标志物，反应系统功能的差异。利用基于核磁共振的代谢组技术分析尿液中代谢物的组成，以反映人体整体代谢状况，可避免技术困难、方法学的差异。

苯甲酸是简单的羧酸，由肠道微生物降解食物中的芳香酸产生，如多酚、嘌呤、芳香有机酸和氨基酸等。在摄入黑茶、绿茶和红茶，以及水果、蔬菜丰富的食物后，马尿酸排泄增加。苯甲酸存在于大量的食物和饮料里，也存在大部分浆果、水果和发酵的奶产品里，因此患儿及健康儿童均正常进食就不会存在苯甲酸摄入不足。

研究长期缺氧婴幼儿和健康幼儿马尿酸的尿液排泄，提示肠道菌群在马尿酸排泄的过程中起关键的作用。研究发现马尿酸水平减少，提示长期缺氧婴幼儿肠道菌群组成发生变化，肠道微生物组成及其代谢仍需进一步研究。

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