肝胆胰恶性肿瘤患者游离DNA的含量及完整性的研究

陈 芳, 谢 丽, 禹立霞, 刘宝瑞

(1. 南京医科大学鼓楼临床医学院肿瘤中心暨南京大学临床肿瘤研究所, 江苏 南京, 210008;2. 安徽省马鞍山十七冶医院, 安徽 马鞍山, 243000)

原发性肝细胞肝癌及胰腺癌的发病率占全部恶性肿瘤的第4及第7位，死亡率分别为第2位及第6位[1]。胆系恶性肿瘤发病率虽然没有前两种肿瘤高，但其预后差，5年生存率仅为2%～4%。这3种肿瘤因为发现时多为晚期，放化疗不敏感，虽经过系统治疗，预后仍不佳。目前，手术仍然是这3种肿瘤主要治疗手段，所以早期诊断尤为重要。但因其解剖原因，目前的检测手段不能满足临床需求。循环游离DNA能够反映肿瘤组织的遗传学及生物学特征，故又被称作“液体组织活检”[2], 以其无创可反复检测而备受关注。本研究以肝、胆、胰腺恶性肿瘤患者为对象，对其外周血中游离DNA含量及完整性进行检测及计算，探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

肿瘤组选择2014年1—3月在南京市鼓楼医院进行手术或穿刺取得病理证实为恶性肿瘤的患者共43例。其中男24例，女19例，年龄34～84岁，中位年龄57岁；原发性肝细胞患者15例，胆道系统肿瘤患者14例(包括肝内胆管细胞癌5例，肝外胆管癌4例，胆囊癌5例)，胰腺癌14例。对照组共40例，其中男22例，女18例，年龄26～74岁，中位年龄50.7岁。

1.2 试剂及仪器

天根生物科技(北京)有限公司的TIANamp Blood DNA kit(天根全血DNA提取试剂盒), AppLera公司生产的SYBR Green PCR Master Mix(2x), 美国Stratagene公司生产的MX 3000P Real Time PCR System荧光定量PCR仪，及国产紫外分光光度计。

1.3 引物

ALU115引物上游: 5-CCTGAGGTCAGGA

GTTCGAG-3; ALU115引物下游:5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3; ALU247引物上游:5-GTGGCTCACGCCTGTTAATC-3; ALU 247引物下游: 5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3。

1.4 实验方法

1.4.1 标本的收集：收集术前肝、胆、胰腺恶性肿瘤患者外周静脉血2 mL, EDTA抗凝。3 000 r/min离心15 min, 分离出400 μL血浆放入EP管中，-80 ℃冷冻保存。正常体检患者血液处理同前。

1.4.2 外周血DNA的提取：按照TIANamp Blood DNA kit试剂盒说明书，抽提所有标本的血浆游离DNA标本，放入-20 ℃冰箱保存，以便统一荧光定量。

1.4.3 标准曲线的建立：以健康人外周血细胞总DNA作为阳性对照，用紫外分光光度计检测含量3次，取平均值，并将其稀释为20.0 ng/μL。后再按5倍梯度稀释，含量分别为4.0 ng/μL、0.8 ng/μL、0.16 ng/μL、0.032 ng/μL、6.4 pg/μL。

1.4.4 PCR反应：采用实时荧光定量PCR进行分析，总反应体系为20 μL, 含2 μL DNA，10 μL SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的二甲基亚砜和7.2 μL去离子水以及10 μmol/mL的引物上、下游各0.2 μL 。PCR扩增条件：95℃预变性10 min, 32个循环的95 ℃变性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s。每批标本均同时设置标准曲线以便绝对定量，并以去离子水作为阴性对照。

1.5 数据处理

游离DNA的完整性=ALU247检测的游离DNA含量/ALU115检测的游离DNA含量。组间及组内比较采用非参数检验，诊断效能判断使用ROC曲线分析。SPSS 17.0统计运算及双尾检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 恶性肿瘤患者组与对照组游离DNA含量及完整性比较

恶性肿瘤患者组短片段游离DNA含量中位数2.89 ng/μL(0.60～50.80ng/μL), 长片段游离DNA含量中位数为1.19 ng/μL (0.34～37.40 ng/μL), 均高于正常对照组0.85 ng/μL(0.49～9.11 ng/μL)及0.28 ng/μL(0.17～2.86 ng/μL), 2组有显著差异(P<0.001)。而肿瘤组完整性0.37(0.15～0.95)相比于对照组0.33(0.08～0.67), 差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 恶性肿瘤患者游离DNA含量及完整性与正常对照组的比较

与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。

2.2 3种肿瘤之间游离DNA含量与完整性的比较

原发性肝细胞肝癌组短片段游离DNA含量中位数2.34 ng/μL, 长片段总游离DNA含量1.12 ng/μL, 完整性0.41; 胆道恶性肿瘤组为3.42 ng/μL, 1.225 ng/μL, 0.28; 胰腺癌组分别4.015 ng/μL, 1.16 ng/μL, 0.28。三种肿瘤在总游离DNA含量及长片段游离DNA含量上无明显差异，而完整性则有明显差异(P=0.033)。其中原发性肝细胞组完整性较对照组高(P=0.022), 而其他两种肿瘤与对照组相比未见差异，见表1。

2.3 恶性患者游离DNA含量及完整性与各临床资料的关系

血浆游离DNA含量及完整性与性别、年龄(≤60岁与>60岁组间)、肿瘤大小(5 cm为界)、神经脉管是否受侵、肿瘤分期无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 肿瘤患者游离DNA含量及完整性与临床指标间的关系

2.4 游离DNA含量与完整性对恶性肿瘤的诊断价值

以ALU115、ALU247为引物测得的游离DNA含量及其完整性制作ROC曲线。其中ALU115片段ROC曲线下的面积(AUC)为0.80，95%的可信区间(CI)为0.71～0.89(P<0.001)。选择其最佳截断浓度为2.21 ng/μL, 灵敏度60%, 特异度86.05%。而以长片段ALU247为引物AUC为0.85, 95% CI为0.77～0.93(P<0.001)。其最佳截断浓度1.92 ng/μL时，此时灵敏度和特异度分别90%和62.79%。以完整性AUC仅为0.56，95% CI为0.44～0.69(P=0.327)。完整性在恶性肿瘤组及对照组无明显差别，不能作为诊断依据。

3 讨 论

众所周知，病理诊断是肿瘤诊断的“金标准”，但肝、胆、胰腺由于其解剖位置的原因，许多肿瘤患者术前未能明确病理，多以影像学检查联合相关肿瘤指标(CEA、AFP、CA199等)临床诊断。但其灵敏度及特异性差，存在一定的误诊误治的情况。且局部穿刺活检，取得少量组织病理，一方面给患者带来巨大痛苦，不利于长期的随访监测；另一方面也很难反映肿瘤总体性状。临床上需要一种能够提供早期诊断、高效、微创、灵敏度及特异性高的诊断方法。外周血游离DNA从1948年被发现至今[3]，经历70多年的历史，尤其是近20年，人们从外周血DNA中发现与肿瘤组织相同的遗传性状[4]，认为其有望代替现有的检测手段用于临床的肿瘤诊断及疗效评估。 近些年，游离DNA的检测多采用实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测办法，该办法在以往的PCR反应的基础上加入荧光基团，利用荧光信号的强弱对PCR反应实时监测，并通过建立标准曲线对未知模板进行绝对定量。而ALU是人类基因组中最常见的重复序列，总长300 bp左右，共占人类基因组的5%～10%, 只要有合适的引物就能对ALU序列进行扩增。两项结合极大提高检测的敏感性，甚至能检测0.1 μL的血液标本[5]。

本实验利用ALU115及ALU247作为引物，建立了相应的标准曲线，分别对肿瘤患者及正常人血浆中的游离DNA进行RTFQ PCR检测，并计算出其完整性及与临床数据进行一些针对性的比较。得出结论示，恶性肿瘤患者血中ALU115片段含量及ALU247片段含量与正常体检者存在明显差异(P<0.001)。且ALU247片段含量在诊断上更加敏感，ROC曲线面积达到0.85，考虑与游离DNA的来源有一定的关系。虽然游离DNA的真正来源尚不明确，但大多数学者[6]认为正常人血中游离DNA来源于细胞的凋亡，而肿瘤患者血中的游离DNA除了来源于细胞凋亡外，还来源于肿瘤细胞的坏死，肿瘤组织[7]及血中循环肿瘤细胞的释放。所以肿瘤患者体内的血中游离DNA的含量及长片段DNA的含量较正常人都更加丰富。Umetani等[8]使用ALU115及247片段扩增乳腺癌及正常患者血中游离DNA，发现在早在Ⅱ期患者血中游离DNA含量显著高于正常(P=0.005)。本实验Ⅰ～Ⅱ期患者血中总游离DNA含量及长片段游离DNA含量为2.70 ng/μL、1.18 ng/μL, 与正常对照组相比有显著差异(P=0.002), 与Umetani的结论一致。考虑与肿瘤早期，细胞增殖较快，大量游离DNA释放入血，与正常对照组有明显区别，敏感性高，对于肿瘤的早期诊断有一定指导意义。另有报道[9]游离DNA含量在各肿瘤类型之间存在区别，如同样使用ALU115为引物，肠癌组患者AUC面积0.75，而壶腹部癌AUC面积仅0.59, 对于诊断的价值有明显差异。故本研究又把3种肿瘤分开与正常对照组比较。结果显示, ALU115片段含量及ALU247片段含量在肝胆胰患者与正常对照组之间虽然仍然有差异。但ALU115片段在原发性肝细胞肝癌诊断价值上(0.013)不如胆系恶性肿瘤及胰腺癌敏感(P<0.001)[10]。

本研究结果显示，游离DNA的总量及长片段的含量与患者的年龄、性别、肿瘤大小、神经受侵、脉管受侵、分期之间均无明显差异。但有关于乳腺癌的研究[5]指出，游离DNA的含量与肿瘤大小相关。同样见于原发性肝细胞肝癌的研究[11-12], 认为肿瘤>5 cm组与≤5 cm组有显著差异(P<0.01), 且在Ⅰ～Ⅱ期患者与Ⅲ～Ⅳ期中有差别(P=0.01)。而本研究并未见相关性，后续可考虑增加样本量进一步研究。本研究结果所示，游离DNA的完整性仅在原发性肝细胞肝癌的诊断上有意义(P=0.022)。而其他数据游离DNA的完整性均无统计学意义。

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