时间分辨免疫荧光法用于梅毒抗体测定的探讨

廖 群,刘小玲,郭 惠

(重庆市急救医疗中心 检验科,重庆400014)

梅毒螺旋体属于密螺旋体属苍白螺旋体中的苍白亚种[1]，是由梅毒螺旋体引起的一种慢性的，系统的传染性疾病，对健康危害程度仅次于艾滋病，几乎可以累及全身各个器官，导致功能障碍。梅毒的传播途径大多数通过性接触传播亦通过血液和垂直传播，是传染性极强的疾病，近年来梅毒在我国的发病率明显增大，其流行对人类的健康形成了严重威胁，也给社会造成了巨大压力。梅毒的早期诊断与防治也成为十分重要的社会和医学问题。2004年12月1日起施行的传染病防治法中将梅毒列为乙类传染病，梅毒的相关血清学检验是目前规定的手术、输血(供、受血者)及各种创伤性检查的患者必须进行的检测项目之一[2]。目前血清学试验是实验室诊断梅毒的主要方法，在梅毒的诊治及研究方面均有重要意义。选择有效的检测方法对梅毒早发现、早诊断、早治疗及正确评价疾病、控制疾病的蔓延有着重大意义。

临床上血清试验主要分为两大类：一类为非TP抗原血清学试验如RPR、TRUST等，主要检测梅毒患者血清中非特异性的类脂质抗体；另一类为TP抗原血清学试验如TPPA，还有ELISA、金标法等。长期以来国内外都在不断探讨更灵敏的梅毒血清学检测技术，近年来时间分辨荧光分析法(TRFIA)的应用使梅毒抗体的检测上了一个新台阶。本实验运用时间分辨荧光分析法与传统的血清学检测方法TPPA、TP-ELISA比较，探讨其在梅毒血清学诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1样本来源血清标本选择来自本院2012年1月至2012年7月门诊患者共计256份。采集静脉血及时离心分离血清，置-20℃冷冻保存；2NICU及1NICU的梅毒质控血清由康彻斯坦提供。

1.2试剂TRFIA试剂盒由苏州新波生物技术有限公司提供，试剂批号2012052001；ELISA试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供，批号为N20121016；TPPA试剂盒由日本富士瑞比欧公司提供，批号VN30203。所有试剂均在有效期内使用。

1.3仪器芬兰MK3酶标仪，恒温水浴箱，新波洗板机，新波EFFICUTA全自动样本前处理系统，新波ANYTST2000时间分辨荧光分析仪。

1.4检测原理TRFIA：用基因重组抗原包被酶标板孔，与待检血清反应后加入铕标记抗原，若存在梅毒抗体则可检测到荧光信号，荧光值与抗体含量呈正比；TPPA：用经裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化，鞣化的羊或禽类红细胞，该红细胞可与待检样本中的梅毒螺旋体抗体结合而出现凝集反应；ELISA：采用双抗原夹心法，利用辣根过氧化酶和底物的结合后颜色变化，在酶标仪上进行检测。

1.5方法

1.5.1 灵敏度、特异性测试 将256份标本分别用TRFIA、ELISA、TPPA三种方法进行检测，统计结果。

1.5.2 精密度检测 将高浓度病人标本混合稀释配成高中低三个梯度标本用TRFIA法进行精密度实验，批内精密度：用三个浓度标本重复测定20次。批间精密度：三个浓度标本每天测定一次，分别测20天，并对测定结果进行统计。

1.5.3 线性试验 将不同浓度(1NICU、2 NICU)质控品分别作1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32倍稀释，用TRFIA法进行检测。

1.5.4 P50检测 将质控标本一系列稀释，用TRFIA法重复测定以确认获得50%阳性及50%阴性结果的稀释度。

1.5.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 诊断评价指标分析 以TPPA试验为对照，对256份标本分别用TPPA，ELISA、TRFIA三种方法测定TP结果，计算灵敏度、特异性和结果符合率见表1。

表1 256例标本用三种方法测定TP结果比较

根据表1数据得出TRFIA与TPPA相比其灵敏度为100%，特异性为98.2%，符合率为98.4%。ELISA与TPPA相比其灵敏度为97%，特异性为94%，符合率为94.5%。

2.2 差异性检验 分别将TRFIA、ELISA法测TP特异性抗体的结果以TPPA检验结果为标准，分类进行两两χ2检验，以判断两种方法的差异有无统计学意义,见表2。

表2 配对χ2检验结果

由表2可得：TPPA和TRFIA、ELISA方法测定梅毒特异性抗体无统计学意义。

2.3 Kappa一致性检验 用SPSS10.0统计软件对检测结果进行Kappa一致性检验，结果见表3。

表3 不同检测方法间Kappa一致性检验结果

仅仅用Kappa来判断两种方法的一致性是不够的，还需要进一步用假设检验进行检验。只有在假设检验判断具有一致性的基础上评价一致性强度才有意义。不同检测方法间假设检验结果见表4。

表4 不同检测方法间假设检验结果

通过假设检验结果判断：TRFIA法测TP特异性抗体与TPPA方法检测结果一致，ELISA法测TP特异性抗体与TPPA方法检测结果一致，但TRFIA法Kappa为0.93>0.75，表明与TPPA方法相比一致性优。ELISA法Kappa为0.72<0.75，表明与TPPA方法相比一致性一般。

2.4 结果的精密度 高中低三种浓度标本测定TP的批内、批间精密度结果见表5。

表5 TRFIA法的批内、批间精密度结果(n=20)

批内、批间精密度均<10%,表明精密度高、重复性好

2.5 线性试验测试结果 质控1NCU、2NCU系列稀释浓度值的变化结果见表6。

表6 TRFIA法测TP的1NICU、2NICU系列稀释度、

注：△相关系数r=0.95，回归方程y=0.1761x+0.0164,▲相关系数r=0.999，回归方程y=0.237x-0.0909。相关系数均>0.9，说明相关性高

2.6 临界浓度的检测 将1NCU的质控品系列稀释，在0.12NCU处用40份重复测定得到45%的阳性结果，55%的阴性结果。则判断该浓度为临界浓度P50。0.15NCU为最低检出浓度P95，0.1NCU为P5。

3 讨论

目前检测梅毒血清学试验的方法很多，其特异性、灵敏度、临床价值有所不同[3-7]。TRFIA、TPPA、ELISA法均检测的是梅毒IgM、IgG混合抗体，早期的IgM抗体和恢复期产生的IgG抗体均会使检测结果为阳性。笔者通过对2012年1月至2012年7月我院256名门诊患者(主要来自于皮肤研究所、妇产科)的梅毒血清学试验结果进行统计分析，发现TP-ELISA法检测阳性率为18.7%，与文献报道接近[8]。通过ELISA、TPPA、TRFIA三种方法对256例血清标本进行TP检测结果比对，ELISA方法检测有48例阳性，阳性率18.7%，TRFIA法39例阳性，阳性率15.2%，而金标准TPPA仅有35例阳性，阳性率13.67%。由此可见与TRFIA、TPPA相比，ELISA测定TP假阳性率相对较高，ELISA影响因素较多，如标本中一些血浆蛋白紊乱，类过氧化物酶样物质的增高等均可造成假阳性。由于酶免疫法酶的抗干扰和灵敏度上比时间分辨法抗干扰的能力稍弱，容易受环境和血液是否溶血、黄疸等因素影响，而致假阳性情况出现，对临床诊断有一定的误导。TRFIA采用基因重组抗原包被酶标板孔，与待检血清反应后加入铕标记抗原，若存在梅毒抗体则可检测到荧光信号，荧光值与抗体含量呈正比。由于采用震荡反应并适当延长孵育时间更有助于提高灵敏度，降低本底[9]。本文结果表明TRFIA法最低检测浓度为0.15NCU。TRFIA分析系统采用波长分辨、时间分辨和1000次均值等方法，提高了系统的灵敏度和特异性，真正实现了零本底测量提高了检测精度[10-11]。与经公认的梅毒血清确证试验[12]TPPA法相比，TRFIA特异性98.2%，灵敏度100%，符合率98.4%,Kappa值0.936，说明TRFIA法具有较高的灵敏度和特异性，与TPPA法相比有很高的一致性。时间分辨免疫荧光技术具有重复性好，批内变异<8%,批间变异<15%表明其精密度、稳定性好。而采用时间分辨荧光分析法全自动样本前处理系统EFFICUTA进行自动加样，可避免造成人为的误差。ELISA与TPPA相比其灵敏度为97%，特异性为94%，符合率为94.5%。ELISA法Kappa为0.72<0.75，表明与TPPA方法相比一致性一般。

时间分辨法可克服酶免和TPPA试剂在环境和血液状态的干扰。虽然有大量资料[13，16]显示ELISA方法敏感性、特异性都较高，但与TRFIA相比，TRFIA的灵敏度、特异性均高于ELISA法。因此TRFIA更适合作为梅毒的初筛实验。虽然ELISA方法也是检测的梅毒特异性抗体，且操作简单，应用酶标仪进行结果判断，客观准确，原始资料也容易保存，是目前临床普遍用于梅毒大批量筛查的方法，由于目前国内各试剂厂家采用的基因重组抗原不同，免疫组份的表达抗原组合含有一些非特异性反应物质使ELISA法存在难以回避的一些致假阳性因素。某些与人类共生的螺旋体也可与ELISA试剂盒中包被的抗原发生交叉反应，使标本中的一些类过氧化物酶样物质的增高和血浆中的蛋白紊乱等引起假阳性结果。TPPA法是目前普遍采用的梅毒抗体确证试验，但试剂成本较高，检测时需将标本作系列稀释，不利于大批量标本检测。TPPA试剂的致敏颗粒溶解后，保存时间较短，约为5天左右，放置时间较长后，吸附在致敏颗粒上的抗原性物质易脱落而致假阴性的出现，以及出现溶血和黄疸现象时，很难通过肉眼观察是否发生凝集，且以肉眼判断结果，原始数据无法保存。不适用大批样本筛查。时间分辨荧光分析技术具有重复性好，标记物存储时间长等优点[17]，在高、中、低浓度的批内、批间变异系数均小于10%，提示系统精密度高。在线性试验时1NICU和2NICU系列稀释后测定结果表现出了较高的线性相关，分别为0.999和0.95，表明相关系数、回归方程均表现出良好等线性。与金标准TPPA相比，灵敏度为100%，特异性为98.2%，符合率为98.4%，表明两者相关性好。两者比较P>0.05,Kappa值为0.93，说明TPPA和TRFIA两种方法测定梅毒特异性抗体结果无统计学意义，一致性好。而其最低检测浓度为0.15NCU，降低了假阴性的风险。

综上所述，用时间分辨荧光免疫分析法检测梅毒非特异性抗体具有灵敏度高、特异性强、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、检测能力强，与TPPA相关性好。尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点，是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法。全自动样本前处理系统EFFICUTA进行加样自动加样，避免了人为误差，是稳定可靠地常规特异性梅毒抗体检测方法，采用计算机控制自动化操作系统，结果判定准确、原始数据容易保存等优点。与TPPA是彼此确认和复核的最佳选择。尤其适合临床进行大批量的筛查实验。

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