α-硫辛酸对溃疡性结肠大鼠模型脂质过氧化损伤的保护作用

李军华，周 薇

(荆门市第一人民医院消化内科，湖北 荆门 448000)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种病因尚不十分清楚的非特异性肠道炎症性疾病，在我国的发病呈上升趋势，其复发率高，目前尚缺乏非常有效的治疗手段[1]。炎症反应及过多的氧自由基(oxygen free radical，OFR)产生及引发的脂质过氧化损伤可通过多种途径参与UC的发病[2，3]。α-硫辛酸(α-LA)属于维生素B类化合物，是一种强的抗氧化剂，具有直接清除活性氧及再生抗氧化剂的作用[4，5]，在糖尿病、冠心病、缺血再灌注损伤保护等方面有确切疗效，但其对溃疡性结肠炎影响的研究较少。本实验观察α-硫辛酸对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜脂质过氧化损伤的影响，探讨α-硫辛酸是否对溃疡性结肠炎具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级健康成年SD大鼠30只，雌雄不拘，体质量180±30g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。实验前大鼠适应性喂养1周，喂养环境温度22℃～24℃，自由饮食水。实验方案符合动物研究指南并经医院医学伦理委员会批准。三硝基苯磺酸为Sigma公司产品， 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和髓过氧化物酶(MPO)，测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，α-硫辛酸(α-LA)为上海现代哈森药业有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立与分组 大鼠溃疡性结肠炎模型参照文献[6]建立。术前禁食24h，自由饮水。30只SD大鼠随机分为对照组、结肠炎模型组及硫辛酸组共3组，每组10只。模型组及硫辛酸组大鼠实验前采用乙醚吸入麻醉，将一直径约2.0 mm的软橡胶管石蜡润滑后由肛门轻缓插入结肠约8cm，将5%(w/v)的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/无水乙醇混合液(体积比1∶1)按100mg/kg(0.4ml/100g)缓慢灌入大鼠肠内；灌肠完成后避免灌注液流出肛门，动物平躺至自然清醒。对照组用生理盐水溶液代替TNBS灌肠，硫辛酸组在造模后给予α-硫辛酸盐液腹腔注射，100mg/(kg·d)，连续两周。每天观察大鼠精神、食欲、腹泻及体重变化等情况并记录，计算疾病活动指数(DAI)[7]。

1.2.2 标本收集与处理 两周后处死大鼠，取肛门至盲肠部结肠，将肠管沿肠系膜纵轴剪开，以冰生理盐水洗净。进行肠道损伤大体形态评分，每例结肠组织分为两部分，一部分卷起来以4.0%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色后进行病理组织学损伤评分，另一部分组织准确称重后剪碎，低温下生理盐水匀浆，一部分匀浆用于检测MPO，余下以3000r/min离心10min后取上清液-80℃保存用于其他生化指标检测。

1.2.3 结肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法 参照文献标准[6，8]略作修改，大体评分指标包括充血水肿、溃疡及粘连，按有无及轻重分别计0、1、2分，溃疡个数每增加1个、溃疡面积每增加1cm2(>2cm2时)计分加1。组织学评分指标为炎症、溃疡及溃疡累及深度，按有无及轻重分别计0、1、2分，病变深度达粘膜下层、肌层、浆膜层分别计1、2、3分，各项相加得总分。

1.2.4 结肠组织MDA、SOD、GSH及MPO检测 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，比色定量法检测GSH含量，分光光度法测定MPO活力；具体操作过程按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况改变 大鼠造模后第1d出现腹泻、稀便，食欲减退，活动减少、精神倦怠，蜷缩，第4d开始模型组大鼠均出现毛色失去光泽，体质量减轻，并有大鼠开始出现血便，上述症状随时间逐渐明显。对照组大鼠体质量增长，无异常表现。α-硫辛酸组与模型组相比，上述症状均有不同程度减轻，α-硫辛酸组大鼠未观察到有肉眼血便情况，DAI评分明显低于模型组(P<0.01)，见表1。

2.2 大鼠肠道大体形态及组织学损伤改变 模型组大鼠结肠炎症改变部位以近肛门段结肠为主，肠粘膜充血水肿明显，可见溃疡形成，溃疡周边粘膜充血水肿。结肠肠管变粗，部分节段见局部膨胀，肠壁变薄。肠壁外周可见粘连形成。α-硫辛酸组大鼠肠粘膜充血水肿明显减轻，偶见溃疡，未见肠管扩张及粘连形成。对照组大鼠肠粘膜血管网清晰，未见明显充血水肿。组织学损伤以粘膜层及粘膜下层常见，可见粘膜缺损或溃疡形成，严重时病变累及到肌层。以中性粒细胞浸润为主，也可见数量不等的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。α-硫辛酸干预组大鼠结肠组织损伤明显减轻，糜烂及溃疡有不同程度修复，肠粘膜可见再生的上皮细胞、腺体及肉芽组织，炎症细胞浸润明显减少，以散在的巨噬细胞和单核细胞为主。大体形态及组织学损伤评分指数差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠结肠大体形态、组织学损伤评分和疾病活动指数比较

2.3 各组大鼠肠组织MDA、SOD、GSH及MPO含量变化 与对照组相比，结肠炎模型组大鼠肠组织MDA、MPO含量明显上升，SOD活性、GSH含量明显降低(P<0.01)，α-硫辛酸组大鼠肠组织MDA、MPO含量较模型组明显下降，SOD活性及GSH含量较模型组显著上升(P<0.01)，与对照组相比无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠结肠组织SOD、MPO活性及MDA、GSH含量比较

3 讨 论

三硝基苯磺酸(TNBS)诱导形成的UC模型与人类UC病理及发病机制有一定相似之处。TNBS是一种半抗原，可与结肠内的自身蛋白结合形成完全抗原，激活粘膜免疫系统，引起一系列免疫应答和炎症反应，是目前筛选新药常用的模型。MPO是中性粒细胞中含量较高的一种酶，其在单核细胞和巨噬细胞中也少量存在，其含量高低可间接反映组织炎症浸润程度，被作为评价肠道炎症严重程度的指标[9]。本实验采用TNBS灌肠造模后，模型组大鼠疾病活动指数，大体形态及组织学损伤评分及MPO含量较正常对照组明显上升，取得较好造模效果。

氧自由基(OFR)在溃疡性结肠炎发病中的作用已得到广泛认同[2，3]。OFR是一类具有高度化学反应活性的含氧基团，可作用细胞中的脂类物质产生脂质过氧化反应，造成组织及细胞损伤。UC中，OFR主要吞噬细胞发挥吞噬作用是大量产生，机体产生的OFR可导致生物膜中多链不饱和脂肪酸过氧化反应直接引起细胞损伤，其还可以增加粘膜通透性，使吞噬细胞活动加强，产生更多的OFR，同时脂质过氧化物的分解产物MDA也能引起细胞膜结构的破坏，蛋白质变性交联，DNA 结构破坏，炎症因子大量释放，加重组织的损害，形成炎症与组织损伤的恶性循环。SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系，能有效地清除氧自由基。而谷肤甘肽(GSH)是一种低分子清除剂，在谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)作用下将过氧化物还原为无害的羟基化合物，同时它也能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤。生理情况下，氧化与抗氧化系统处于动态平衡。直接测定OFR非常困难，由于MDA是脂质过氧化的终末产物，因此其含量可反映机体脂质化损伤的程度，SOD活力及GSH含量间接反映了机体清除氧自由基的能力。本实验结果显示，UC大鼠肠组织中MDA含量较正常大鼠明显上升，SOD活力及GSH含量明显下降，支持了氧自由基导致脂质过氧化损伤参与UC发病的观点。

阻断OFR产生或提高机体清除OFR能力可阻断炎症发展的恶性循环，研究具有抗氧化活性的药物对UC的作用一直是临床关注的热点问题。α-硫辛酸是在已知天然抗氧化剂中效果最强的，兼具脂溶性和水溶性，具有显著的亲电性和与自由基反应能力，可以清除活性氧自由基，同时它还能再生内源性抗氧化剂如GSH等，提高抗氧化酶的活性，被称为“抗氧化剂的抗氧化剂”。本实验结果显示，α-硫辛酸干预处理溃疡性结肠炎大鼠后，大鼠疾病活动指数与肠道损伤程度较模型组明显减轻，同时发现，α-硫辛酸组大鼠肠组织中MDA、MPO含量较模型组明显降低，SOD活性和GSH含量较模型组大鼠明显提升。实验结果提示α-硫辛酸对UC大鼠具有良好的保护作用，其机制与清除氧自由基，提升SOD活性和GSH含量，减轻脂质过氧化损伤有关。本实验为α-硫辛酸应用与UC临床治疗提供了实验依据。

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