豚鼠树突状细胞的诱导与特性分析

刘 升

(中国科学院大学，北京 100049)

1973年Steinman[1]首次分离出树突状细胞。树突状细胞是目前已知功能最强的专职性抗原提呈细胞，其激活T淋巴细胞的能力较巨噬细胞、B淋巴细胞强100 ～ 1 000倍以上，并且是唯一能激活初始免疫应答的抗原提呈细胞[2-4]。正如我国曹雪涛院士所阐述的，树突状细胞是人体内数量极少且功能最强的抗原提呈细胞，是人体建立完善免疫学“防御机制”的基础。随着人们对树突状细胞的生物学特性及功能的了解不断加深并在某些疾病的基础研究和临床防控应用中取得了令人鼓舞的成果，树突状细胞的重要性也越来越受到人们的重视。

由于树突状细胞在外周血中含量极少，仅占单核细胞总数的0.1%～10%，分离纯化困难，故临床应用受到极大限制，因此成熟的树突状细胞体外培养技术的建立是获得足够数量的具有功能作用的树突状细胞的另一重要有效途径。近年来，在体外采用了多种不同的分化途径诱导扩增树突状细胞的研究，包括用人脐血[5]、骨髓[6]和粒细胞集落刺激因子动员后外周血中的造血干/祖细胞或单核细胞体外诱导扩增[7]，并已获得成功。用于培养树突状细胞的细胞因子有很多，其中主要有粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、干扰素α、Flt3配体和白细胞介素13等[8]，在相差显微镜及电镜下观察，所培养的细胞均具有典型的树突状细胞形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞[9]。

树突状细胞在体内分布广泛，但数量较少，因此如何获得大量的树突状细胞就成为进一步研究树突状细胞特性和功能的前提。豚鼠由于其在生理学与免疫应答等方面与人类有极高的相似性，并且关于豚鼠树突状细胞相关的研究报导很少，因此，我们的实验在体外培养扩增了豚鼠骨髓树突状细胞，为优化树突状细胞的体外培养和建立能获得大量具有抗原提呈功能的树突状细胞的方法体系提供实验数据。

1 实验材料

1.1 实验动物

豚鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)(美国Tepro-tech公司)；RPMI 1640培养液、红细胞裂解液、体积分数为75% 乙醇(实验室自配)；胎牛血清(美国 Hyclone公司)、青霉素、链霉素、PBS缓冲液、结核分枝杆菌弱毒卡介苗(BCG)(实验室保存)；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(上海萨博生物有限公司)。

1.3 仪器设备

超净工作台(江苏净化仪器制造厂)；CO2细胞培养箱(上海旦鼎国际贸易有限公司)；离心机、倒置荧光显微镜(日本OLMPUS，IX71)；流式细胞仪 、电子天平(德国 METTLER)。

2 实验方法

2.1 豚鼠骨髓来源树突状细胞的培养[3-5]

2.1.1 豚鼠骨髓细胞的制备 将豚鼠脱颈处死,无菌操作取出股骨、胫骨及肱骨,尽量将肌肉和结缔组织去除。切除取出的骨的两端,在含有青、链霉素双抗的PBS缓冲液的培养皿中，用5 mL无菌注射器反复冲洗骨髓。将冲洗液收入15 mL离心管中，以1∶5 的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，置室温5 min，离心， 1 000 r/min，5 min，弃上清液除去红细胞，再经细胞培养液洗涤1次，离心收集沉淀的骨髓细胞[10]。

2.1.2 树突状细胞的诱导及培养 将骨髓细胞重悬于细胞培养液中，调整细胞浓度，接种于100 mm培养皿中，每皿加10 mL体积分数为10%胎牛血清及双抗(含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L)的RPMI 1640培养液。将细胞轻轻摇匀置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，2 h后，吸取未贴壁的悬浮细胞，再用培养液轻轻冲洗以去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞[11-12]。

将细胞分为细胞因子诱导组和对照组。诱导组细胞培养液中添加诱导因子GM-CSF、IL-4(浓度分别为20 μg/L和10 μg/L),每2 d换液1次。

2.2 树突状细胞的表型鉴定与特性分析

2.2.1 倒置显微镜观察 在倒置显微镜下观察树突状细胞形态及数量的变化，并拍照。

2.2.2 免疫荧光细胞化学 培养的细胞用PBS洗3次，用40 g/L 的多聚甲醛室温固定30 min，固定的细胞用PBST(含有体积分数为0.2%的Triton X-100)洗涤3次后，用PBST在室温下透膜10 min，洗涤后细胞置于含体积分数为10%山羊血清和 50 g/L脱脂奶粉的PBST中，室温下封闭30 min。然后置于用含20 g/L脱脂奶粉、体积分数为10 %山羊血清的PBST稀释后的CD14一抗中，4 ℃冰箱过夜。用PBST洗涤3次，室温下置于用含20 g/L脱脂奶粉、体积分数为10% 山羊血清的PBST稀释后的二抗中，孵育1 h[鼠抗CD14，1∶100，二抗为荧光标记的goat anti-mouse IgG+IgA+IgM( H+L )FITC conjugate][12-13]。荧光显微镜下拍照。

2.2.3 BCG诱导树突状细胞凋亡分析 取12 孔细胞培养板，分别接种浓度为5.0×105/mL的树突状细胞1 mL，置37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱孵育2 h。小心吸弃培养液，按细菌∶细胞=100∶1的比例，每孔加入浓度为5.2×107CFU/mL 的BCG悬液 1 mL，37 ℃ 孵育24 h， PBS 洗3次，然后分别用 Annexin V-FITC 和 Propidiumiodide( PI) 染色，按 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒操作说明书，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。未用BCG刺激培养的树突状细胞为对照组[14-15]。

3 结果

3.1 体外培养树突状细胞倒置显微镜观察结果

由豚鼠骨髓直接分离的树突状细胞量很少,经GM-CSF和IL-4诱导分化培养3 d后树突状细胞量逐渐增多, 2周后细胞计数扩增至70%～80%。

在倒置显微镜下可见，培养1 d的细胞贴壁生长, 有细胞聚集现象, 呈均匀分布的细胞集落，细胞体积小,形状不规则,边缘可见细小伪足,无树枝样突起。培养3 d后,细胞成簇生长,大多数细胞仍然贴壁,少数细胞处于半悬浮状态,细胞体积与以前接近,细胞核呈圆形或椭圆形，较小,细胞周边可见毛刺状突起,但毛刺较短,分枝较少。培养 5 d后,较多细胞呈半悬浮生长,可见大部分细胞呈梭形及不规则形状，细胞体积较以前增大,分别聚集生长,周边可见明显的刺状突起,突起较长,可见分枝。培养7 d后,细胞体积较前增大,周边刺突十分明显,突起较粗大,分枝较明显,细胞形态似星形或梭形,细胞核明显,细胞聚集生长。培养10 d后,细胞生长旺盛,细胞体积增大,具有明显树枝状突起,突起粗大且较长,胞体相对饱满,细胞形态呈星形、多边形或梭形。培养14 d后,大多数细胞出现悬浮生长,呈现典型的树突状细胞形态, 细胞呈星形或梭形,形似“海星”细胞核清晰可见,细胞表面突起增多,细长,分支较多,呈蔓状分布于细胞表面,形似树枝状。见图1、图2、图3。

3.2 化学免疫检测

经GM-CSF和IL-4诱导分化培养的豚鼠树突状细胞，经免疫荧光细胞化学检测，细胞呈CD14阳性。见图4。

3.3 BCG诱导树突状细胞凋亡分析

流式细胞仪结合Annexin V-FITC 标记法检测发现，BCG与树突状细胞混合培养24 h后，细胞凋亡率为18.95%，显著高于对照组4.3%。见图5。

图1 培养3 d后的细胞

图2 培养5 d后的细胞

图3 培养10 d后的细胞

a：相差显微镜；b：荧光显微镜。

a：BCG与树突状细胞混合培养24 h组；b：对照组。

4 分析与讨论

我们的实验对培养的豚鼠树突状细胞形态学和免疫表型进行了鉴定，保证了培养体系的正确。形态学方面,骨髓中单核细胞在培养3 d以后,部分细胞出现不规则的树突样突起,与相关文献[13]报道一致。树突状细胞成熟与否与其表面标记分子表达程度的高低有关。在树突状细胞的表型鉴定方面,豚鼠的表面标记物中较为常用的为MHC2II类表面黏附分子CD14，可作为豚鼠DC表面的特异性标记物[14]。实验将豚鼠的特异性标记CD14作为鉴定的指标,其表达符合树突状的成熟状态。诱导宿主细胞凋亡是许多病原微生物重要的致病机制[15-16]。实验中BCG与树突状细胞混合培养24 h后，细胞凋亡率为18.95%，显著高于对照组4.30%，从而提示BCG在与树突状细胞混合培养中可诱导树突状细胞发生凋亡。据此推测，这种BCG诱导树突状细胞的凋亡作用，可能对有效地控制结核分枝杆菌在胞内的生存、繁殖和扩散有着重要的意义。

我们的实验所采用的树突状细胞体外原代培养的方法，成功建立了体外获得大量成熟树突状细胞的方法体系，为进一步研究树突状细胞的特性和功能提供实验材料，而且培养的树突状细胞具有一定的纯度和保持体内树突状细胞所具有的生物学特征。这不仅为树突状细胞的体外培养提供了有效的研究方法，而且也为在细胞水平研究树突状细胞的表型、功能及免疫治疗等提供可靠的体外实验材料。

(从课题的选择到实验的过程再到论文的撰写，均在吴月红教授的悉心指导下完成。在此，对我的导师吴月红教授致以诚挚的谢意。)

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