HPLC法测定组织中硫酸长春新碱的含量

齐 鹏,张永旺

(天津中医药研究院 附属医院,天津 300120)

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津 LC-6A 高效液相色谱仪(LC-6A输液泵，SPD-10A紫外检测器，Anastar色谱工作站)；色谱分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，天津色谱科学技术公司)；电子分析天平(BP211D,Sartorius)；KQ2200 超声波清洗器(昆明市超声波仪器厂)；液体快速混合器(江西医疗器械厂)，离心机。

1.2 试药

硫酸长春新碱对照品(VCR)(中国药品生物制品检定所，批号：20061211)；甲醇：色谱纯(天津市彪仕奇科技发展有限公司，批号：06112802)；磷酸二氢钾：分析纯(天津市标准科技有限公司，批号：20050510)；乙腈：色谱纯(天津市彪仕奇科技发展有限公司，批号：07011201)；其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。肿瘤组织样品为新鲜、经低温速冻的荷瘤裸鼠眼眶腺样囊性癌细胞，由天津医科大学第二附属医院提供。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil-C18柱(250 mm×Φ4.6 mm，5 μm)；流动相：0.02 mol/L KH2PO4水溶液(三乙胺调pH=7.0):CH3OH(28∶72,V/V)；检测波长：298 nm；柱温：室温；灵敏度：0.002AUFS；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液制备

精密称取硫酸长春新碱对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀 ；精密量取500 μL, 置于10 mL量瓶中,用流动相稀释并定容，摇匀，即得5 μg/mL的VCR对照品溶液储备液。

2.3 供试品溶液制备

取一定量肿瘤组织样品，于2.5 mL硬质试管中，捣碎。加稀硫酸(pH=3)200 μL，混匀3 min，再加200 μL乙腈混匀，高速离心(13 000 r/min)4 min，取上清液，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

取一定量空白组织样品，按照供试品溶液的制备方法进行，即得阴性对照溶液。

3 实验结果

3.1 系统适用性试验

按2.1项下色谱条件,分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液10 μL 进样。在此条件下硫酸长春新碱理论板数大于3 000 ;硫酸长春新碱与其成分能有效分离;供试品中的其他成分对测定成分无干扰(见图1, 2, 3) 。

A 硫酸长春新碱

图2 空白组织样品色谱图

A 硫酸长春新碱

3.2 线性实验

精密量取储备液50、100、150、250、500、1000 μL、2000 μL，置10 mL量瓶中，加流动相至刻度，分别得到浓度为0.025、0.05、0.075、0.125、0.25 、0.5、1 μg/mL标准液。按2.1项下分别进样20 μL, 以浓度(μg/mL) 为横坐标、峰面积为纵坐标,求得回归方程为:Y=65 014X+ 2 130.6，r=0.9 999。线性范围为(0.025～1)μg/mL。结果表明，硫酸长春新碱浓度在(0.025～1)μg/m)范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

3.3 精密度试验

分别取0.125 μg/mL的对照品容液，连续进样6次，每次20 μL，测得峰面积，RSD为2.71%。

3.4 稳定性试验

取线性范围内的同一供试品溶液, 分别在0、2、4、8、12、24 h 进样20 μL , 测得峰面积,RSD为3.31%。表明样品溶液在24 h内是稳定的。

3.5 重复性试验

取同一批样品，按照供试品溶液的制备方法，按照2.1项下的色谱条件连续测定6次，，结果长春新碱的含量RSD为2.6%。

3.6 回收率试验

取9份空白肿瘤组织，于2.5 mL硬质试管中，捣碎。分别加0.05 μg/mL的对照品液100 μL，0.125 μg/mL的对照品液100 μL，1 μg/mL的对照品液100 μL，漩涡震荡5 min混匀。混匀后，每份加稀硫酸(pH=3)100 μL，混匀3 min，再加200 μL乙腈混匀，高速离心(13 000 r/min)4 min。每个水平平行做三个平行样。计算平均回收率为98.28%。RSD为2.43%。结果见表1。

3.7 样品含量测定

按2.3项下方法制备供试品溶液,照2.1 项下色谱条件测定,用外标法计算含量。数据可看出局部注射给药后第1、3、5、7(第二次给药前)、11、14 d，两次给药后的荷瘤裸鼠腺样囊性癌细胞中的VCR含量变化，结果见表2。

表1 加样回收率试验测定结果(n=3)

表2 肿瘤组织中VCR的含量(n=6)

4 讨论

4.1 流动相pH值的选择[1]

流动相偏酸性时，出峰时间太早，影响分离，流动相不调pH值，长春新碱的色谱峰有拖尾现象，为调整出峰时间、改善峰形，用三乙胺调节流动相的pH值，发现pH=7时，峰形较好。

4.2 参考相关文献

肿瘤组织样品的处理方法用二氯甲烷提取，经过实际的实验摸索，此方法提取回收量太低。曾经试用氯仿、乙酸乙酯-异丙醇(8∶2)、将组织先酸化，加乙醚除杂，将酸液层加碱中和，再用乙醚提取等方法，但经试验效果并不理想，提取回收的率太低。将组织酸化后直接进样[2]，浓度太低，而且杂峰较多。最终，我们实验采用将组织酸化后用乙腈沉淀蛋白，离心，取清夜吹干，复溶后进样。

HPLC法操作简便, 分离度好, 准确度高, 重现性好, 回收率高, 可作为组织中硫酸长春新碱含量的测定方法，为临床研究提供可靠的数据参考，为长春新碱新剂型的含量测定提供可行的方法学依据。

参考文献：

[1] 孙勇，吴晓渔.反相高效液相色谱法测定硫酸长春新碱的含量[J]． 中国药房，1999，10(6)：274—275．

[2] 国家药典委员会．中国药典2005年版(二部)[M]．北京：化学工业出版社，2005：721-722.