小麦单倍体诱导技术及其应用

董艳辉 ，于宇凤 ，赵兴华 ，王长彪 ，任永康 ，唐朝晖

（1.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；2.太原市外国语学校，山西太原030027；3.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032）

单倍体是指具有配子染色体数的个体，利用小麦单倍体诱导技术产生单倍体并加倍获得全部基因同质的纯合二倍体纯系，是快速培育小麦新品种和构建特殊遗传群体的重要途径[1]。目前，小麦单倍体获得途径主要包括花药培养、花粉（小孢子）培养、异源种属花粉诱导（染色体消除）以及辐射和化学试剂处理等[2]。其中以小麦花药培养技术获得小麦单倍体比较成熟，现已建立了完整的技术体系，选育了诸如京花1号、京花10号、花培3号、花培5号、花培6号、奎花1号、陕农28等一系列优良的小麦品种，其在生产上大面积推广种植，取得了良好的社会经济效益[3]。

本文综述了目前主要的小麦单倍体诱导技术在国内外的最新研究进展及其在应用中存在的问题，旨在为相关专业研究人员提供参考，促进小麦单倍体育种技术的进一步发展和完善。

1 小麦单倍体诱导技术

1.1 花药培养技术

小麦花药培养育种是20世纪70年代开始发展起来的一种新型育种方法，以其周期短、性状选择准确、创造变异和DH群体快等独特优势受到小麦育种者的高度重视，其在理论和应用研究方面都得到了较大的发展，已经形成一个比较完善的育种技术体系。但是该技术还存在基因型依赖、白化苗等问题，限制了小麦花药培养的绿苗分化率。

小麦花药培养力高低受自身基因型的显著影响，不同品种的花药愈伤组织诱导率差异比较大。韩晓峰等[4]通过对不同亲本组合进行研究，结果表明，花药培养力的遗传为多基因控制的数量性状，通过桥梁亲本可以改善花药培养力低但农艺性状优良的亲本，一定程度上降低了基因型依赖性对小麦花药培养的影响；徐龙珠等[5]通过对同一组合的正交反交研究表明，母本对花培诱导率的影响大于父本，可能存在着细胞质效应；康明辉等[6]通过长期的实践指出，在选配亲本时除了要考虑花培效率高的桥梁亲本，还要兼顾中心亲本的优良性状，以提高花药培养后代优良基因型出现的概率。

大量研究表明，小麦花药培养中会产生大量的白化苗。花粉白化苗的大量存在成为禾本科植物花药培养在育种实践上应用的重要障碍，因此，研究白化苗的成因、寻求控制方法不仅是花药培养中亟待解决的问题，而且对探讨发育遗传学、高等植物的基因调控等重要理论问题也意义重大。白化苗的产生受基因型、培养基、培养条件等因素的影响，通过改善这些因素可在一定程度上减少白化苗的产生，但还未达到理想的效果。叶兴国等[7-8]利用RAPD分析了来自同一基因型的绿苗和白化苗，结果表明，白化苗的发生属于遗传原因，是染色体上DNA结构的改变引起控制叶绿素的基因突变，而不同基因型对培养基的化学成分敏感度不同，导致不同基因型白化苗率不同；Torp等[9]应用RFLP技术成功检测到3个与绿苗再生相关的QTL位点，分别在2AL，2BL，5BL上；海燕等[10]在分化培养基上附加稀土的研究表明，附加1.5 mg/L的稀土能够显著提高花粉绿苗分化率，从13.72%提高到27.51%；蒋宁等[11]通过对大量杂交组合花药培养的诱导培养基中添加植物生长调节剂4PU-30的研究表明，适宜浓度的4PU-30能显著提高愈伤组织分化绿苗的比例，降低白化苗的比例。因此，随着研究的不断深入、材料的不断积累和培养基的不断调整，小麦花药培养技术正向着更能克服各种限制因素的方向发展。

1.2 花粉（小孢子）培养技术

小孢子培养是在花药培养的基础上发展起来的一种高效再生技术体系，属于单细胞培养，与属于器官培养的花药培养不同。与花药培养相比，小孢子培养主要是通过胚胎发生途径发育成植株，避免了愈伤组织阶段，减少因孢子体变异而引起的农艺性状退化，显著提高单倍体产生频率和减少白化苗的产生量[3]。因此，国内外都开展了此项研究，并且在甘蓝型油菜、马铃薯、大麦、水稻、玉米、小麦、亚麻等粮经作物以及众多芸薹属蔬菜上获得成功。

小孢子培养技术在麦类作物中的大麦上研究比较深入，但直到1993年Tuvesson等[12]才成功地报道小麦的小孢子培养植株。近年来，国际上有关花粉培养技术的研究进展很大，已成功建立了小麦小孢子的培养体系，同时在克服基因型限制问题上也有了一定的进展。目前，用于小麦小孢子的分离方法共有4种，即振荡、漂浮、离析和搅拌。Gustafson等[13]通过测定分离后的小孢子活力对4种分离方法进行比较研究认为，振荡方法是最佳的分离方法，在游离小孢子培养的液体培养基中加入未成熟子房，可以大大改善小孢子的培养反应，提高胚胎的发生频率。Mejza等[14]研究认为，子房对小孢子起到一种看护作用，小孢子胚胎的形成是子房的生物功能，但具体作用机理还不清楚。Scott等[15]在麦芽糖以及麦芽糖结合不同浓度的葡萄糖、蔗糖和甘露糖的对比试验中发现，只含有麦芽糖的培养基能有效地诱导小麦小孢子发育成胚胎，而在含有其他种类碳源的培养基上，小孢子开始积累淀粉粒，最终死亡，没能成功地诱导出胚胎。还有研究表明，低温处理、饥饿加高温胁迫处理能够有效提高小孢子胚胎发生率。但饥饿加高温胁迫处理是否会对小孢子胚胎自然加倍率产生负面影响还需要进一步研究。

与花药培养相似，小麦小孢子培养中也存在白化苗和基因型限制问题。小孢子培养的研究表明，再生苗中白化苗的比率存在明显的基因型依赖性，有的基因型再生苗中70%为绿苗，而有的基因型中只有少数几株绿苗，这还有待于进一步研究。值得高兴的是，小孢子培养中基因型限制问题比花药培养中表现得要轻。Touraev等[16]通过前期的胁迫处理和小孢子的分离纯化，在供试的若干基因型中都以较高频率得到了胚胎，其中包括在花药培养中反应极差的基因型。说明小麦单倍体生产中基因型限制问题有望通过小孢子培养得到克服。

1.3 异源种属花粉诱导（染色体消除）

Wilson[17]首次进行小麦与黑麦属间杂交，开拓了小麦远缘杂交育种的新领域。后来，随着小麦远缘杂交工作的不断进展，人们逐渐发现，在小麦与大麦、玉米、高粱、珍珠粟、大刍草的杂交中都能有效地诱导小麦单倍体的产生，但是种间杂交导致体细胞染色体消失的分子基础尚不清楚。有一种假说认为，存在种间差异的亲本着丝粒与纺锤体之间发生互作而导致染色体选择性消失。

Lein[18]研究发现，小麦与黑麦的可交配性是由Kr1，Kr2这2个显性基因控制，并推测Kr基因可能控制着普通小麦与其他种属杂交的亲和性。因而，可交配基因Kr的发现为小麦远缘杂交奠定了理论基础。宋仁敬[19]成功地用球茎大麦法获得了小麦单倍体，但是，由于许多小麦品种带有显性Kr1和Kr2基因，限制了小麦与四倍体球茎大麦杂交产生单倍体的方法在育种上的应用。

Zenkteler等[20]首次报道了玉米花粉诱导小麦获得球形胚。现有研究表明，玉米对小麦可交配基因Kr不敏感，单倍体的产生对于小麦基因型没有严格的选择，开辟了小麦单倍体育种的新途径。Laurie[21]首次利用小穗培养法获得小麦与玉米杂交产生的单倍体植株。Niroula等[22]研究了玉米基因型对胚形成和幼苗再生的影响，结果表明，玉米基因型对单倍体胚形成和小穗再生的差异很大。因此，通过选择和培育更敏感的玉米基因型可以提高单倍体胚诱导。小麦×玉米诱导单倍体诱导技术具有单倍体诱导效率高、不产生白化苗和诱导小麦单倍体遗传稳定性高等优点，经过近年来迅速发展，该方法已成为目前国内外产生小麦单倍体的重要途径。

最新研究表明[23-24]，通过对着丝粒特异性组蛋白基因CENH3进行改造得到突变体，然后杂交得到杂合型合子，由于双方亲本的着丝粒互作，使得来自突变体的染色体组在合子的有丝分裂中丢失，经发育得到只含有非突变体亲本一套染色体的植株，单倍体诱导率达50%。这一技术已在拟南芥试验中取得成功，由于CENH3普遍存在于真核生物中，且拟南芥细胞中着丝粒的DNA结构与大部分植物细胞内的着丝粒DNA结构有很大的相似性，因此，相信这一方法也可用于小麦单倍体育种中。

1.4 辐射和化学诱导

利用X，γ，32P，60Co等射线和紫外线照射花粉，然后给去雄的母本授粉，刺激卵细胞分裂并发育成单倍体的胚胎，从而得到母系单倍体植株。这一项技术已经在很多植物中取得成功。

化学药剂诱导小麦孤雌生殖在育种实践上有一定的目的性和预见性，操作相对简便，成本也较低。但存在因诱导效果差而造成优良基因型丢失的缺点。目前，主要诱导药剂有：DMSO，BA，KT，2，4-D，NAA，GA3，TRTA，DMSO＋对氯苯氧乙酸，DMSO＋KT，DMSO＋GA3，DMSO＋NAA，DMSO＋KT＋邻氯苯氧乙酸和甲苯胺蓝等。

该方法适合小麦花药培养、花粉（小孢子）培养不易成功的基因型，选择合适的辐射剂量或药剂浓度是该方法成功的关键，也是本研究的难点。

2 小麦单倍体加倍

小麦单倍体诱导技术已经被广大小麦育种者广泛应用，但是单倍体植株的加倍问题依旧是育种者需要进一步探讨和解决的问题，目前主要的方法有自然加倍和人工加倍。

花药、花粉（小孢子）培养得到的单倍体植株都具有自然加倍的现象，但因基因型等的不同自然加倍率也有所不同。花药培养植株自然加倍率一般在20%～30%之间[25]；小麦的小孢子培养中，有20%～78%的再生绿色植株是加倍的，具体的加倍机理还不清楚。但是通过一些处理方法也能够提高自然加倍率，比如冷处理、饥饿处理和高温胁迫等，冷处理能够提高自然加倍率已经在花药培养和小孢子培养中得到证实。异源种属花粉诱导获得的小麦单倍体染色体自然加倍现象较少，特别是小麦×玉米产生的植株基本上是单倍体。

由于自然加倍率低，且部分单倍体无自然加倍现象，因此，对于小麦单倍体植株加倍，许多小麦育种者进行了多方面的试验研究，提出过多种加倍方法，其中秋水仙碱法应用比较广泛。目前，报道较多的是用高浓度的秋水仙碱处理幼苗根部，但是高浓度的秋水仙碱对植株的毒害作用比较大，加倍处理后较难成活，降低了加倍率；同时由于秋水仙碱作用停止后，会产生部分非二倍体植株。有报道用一定浓度的秋水仙碱和DMSO结合处理单倍体植株，加倍效率显著提高；河南省农业科学院海燕等[25]设计的小麦半浸根染色体加倍技术，加倍后成活株率达98.1%；成活株加倍结实株率稳定在80%，在花药培养获得的幼苗中取得了良好的应用效果。

目前，通过秋水仙碱等化学药品的处理，不需要任何特定的基因型很容易能获得小麦加倍单倍体，但染色体自然加倍所形成的加倍单倍体和人工加倍获得的加倍单倍体不同，前者除整双二倍体外常还有非整倍体，利用这些非整倍体可培育添加系、替换系等，还可用来进行基因定位，在引入外源基因的杂交育种中，这些非整倍体的应用要比整倍体更为广泛。所以，很多组培工作者仍然采用单倍体植株的自然加倍方法：为了进一步利用自然加倍不成功的单倍体植株，以保住特定情况下的优良材料，研究人员采用单倍体植株幼穗或者叶片进行离体培养，使其再次自然加倍，并且已经取得了成功。

3 展望

从小麦杂交育种到现在可以预见性地通过多种途径获得优良小麦材料，这不得不说是小麦单倍体诱导技术的巨大贡献。目前，其已在小麦基础研究和育种方面发挥了重要的作用，但是这些技术的应用仅仅局限于在相对较短的时间内得到基因型纯合的小麦植株和实现杂种优势育种方面，有关小麦自然加倍和人工加倍倍性效应表达调控机理以及遗传行为的研究只是局限在基因组的某个特异位点，还不能极大地满足小麦育种的需求。可以预见，随着染色体工程的建立与应用，RNAi等一系列先进技术的涌现，自然加倍与人工加倍植株的加倍机理和遗传行为进一步明确，将为小麦单倍体育种研究提供更为广阔的思路与方法。

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