响应面分析法优化湿地松松针中酪氨酸酶抑制剂提取工艺

季寅寅，江震宇，朱 晨，张佳艳，周珊珊，徐丽珊

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

酪氨酸酶是目前已知的生物体内合成黑色素的关键酶[1]，它与人体肤色以及雀斑、褐斑等黑色素过度沉积的疾病发生有关[2]。在黑色素细胞内，酪氨酸在酪氨酸酶作用下氧化为多巴、多巴醌，多巴醌经一系列的反应，最终合成黑色素[3]，因此，可以通过抑制酪氨酸酶活性阻断黑色素合成。而植物源酪氨酸酶抑制剂在化妆品领域具有重要的应用价值[4-6]，熊果苷就是一种目前市场上广泛使用的通过抑制酪氨酸酶活性以达到美白效果的植物源美白剂[7]。另外，研究表明，酪氨酸酶抑制剂可以防止果蔬褐化[8]，影响昆虫的蜕皮[9]。

我国松属资源丰富，南方地区种植了大面积的湿地松（Pinus elliottii Engelm.），形成了多个人工湿地松林区。湿地松具有良好的适应性和抗逆力，其松针是一种可持续的再生性资源，储备量大，无毒，但目前还没有得到很好的开发利用[10]。

本研究以湿地松松针为原料，优化酪氨酸酶抑制剂的提取工艺。研究结果可以为开发湿地松松针源酪氨酸酶抑制剂，并使其进一步应用于化妆品、食品和药物领域提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 岛津UV-2550紫外分光光度计（岛津制作所）、水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）、DZF-6050B真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、BPG-9070A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、CT 15RE日立台式离心机、pH计。

1.1.2 主要试剂 酪氨酸酶（日本Wako公司）、L-酪氨酸（上海宝曼生物科技有限公司）、熊果苷（上海宝曼生物科技有限公司）。

1.1.3 试验材料 供试材料为湿地松（Pinus elliottii Engelm.）松针。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶活性及抑制能力的测定 在酪氨酸酶催化反应生成黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化反应主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这2个阶段[11]。多巴醌是红色物质，在一定波长下（475 nm）有最大吸收，可进行测定[12]，在一定范围内，红色的深浅与多巴醌含量的多少成正比，单位时间多巴醌的生成量可用来表示酪氨酸酶的活性。在相同条件下，加入抑制剂，以多巴醌的减少量表示对酪氨酸酶的抑制能力。

L-酪氨酸溶液、酶溶液均用0.2 mol/L，pH值为6.8的磷酸缓冲溶液配制。按表1准确吸取A，B，C，D组反应液，在37℃水浴中充分反应，6 min时于475 nm处测定吸光值A，按公式（1）计算抑制率。

表1 酪氨酸酶催化反应混合体系 μL

式中，A475B为底物与酪氨酸酶反应6 min时的吸光值；A475D为底物与酪氨酸酶在抑制剂存在下体系反应6 min时的吸光值。

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性成分提取的单因素试验称取一定量烘干的湿地松松针，按单因素试验设计[13]（料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）、乙醇浓度（0，25%，50%，75%，100%）、浸提温度（20，40，60，80，100 ℃）、浸提时间（0.5，1，2，3 h））进行提取，提取液经抽滤后定容至5 mg/mL（以湿地松松针的干质量计），测定其对酪氨酸酶活性的抑制能力。

1.2.3 响应曲面法试验设计 以湿地松松针提取物对酪氨酸酶的抑制率为目标函数，根据单因素试验的结果选取主要影响因素，采用Design-Expert 8.05b统计软件中的Box-Benhnken（BBD）试验设计法进行设计及数据分析[14-15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

以湿地松松针为原料，考察料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间对提取液的酪氨酸酶抑制活性的影响（图 1）。

由图1可知，料液比、乙醇浓度、浸提温度对湿地松松针中酪氨酸酶抑制成分提取的影响较为明显，分别在料液比为1∶15、乙醇浓度为50%、提取温度为80℃时抑制率达到最大。对乙醇浓度进行进一步细化试验得知，乙醇浓度为60%时的抑制率大于50%时的抑制率。随着浸提时间的延长，湿地松松针粗提物对酪氨酸酶的抑制作用增大，提取时间为1 h时的抑制率显著高于0.5 h，而1，2 h间差异不显著，为了提高效率，选择的浸提时间为1 h。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 试验结果与分析 根据单因素的试验结果确定料液比、乙醇浓度和提取温度为拟合因素。试验拟合因素编码以及水平[15]列于表2。

表2 试验拟合因素编码及水平

以湿地松松针提取物对酪氨酸酶活性的抑制率为评价指标，设计3因素3水平共17个试验点，含4个中心点重复，得到结果如表3所示。

二次响应面回归模型为：抑制率（%）＝61.95＋4.21×A－4.65×B＋15.57×C－1.85×A×B＋3.57×A×C－0.99×B×C＋2.05×A2－5.81×B2－22.83×C2。

方差分析结果列于表4。

表3 响应面试验设计及结果

表4 响应面二次模型及其回归系数的方差分析结果

从表4可以看出，3个因素对酪氨酸酶抑制率的影响都很显著，影响程度从大到小依次为提取温度、乙醇浓度、料液比；且响应回归模型为极可信，试验结果能与回归方程良好地拟合，各拟合因素间并非简单的线性关系。各试验因素对响应值的相关系数 R2＝4 724.33/4 733.86＝0.998＞0.8，说明抑制率实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此，该模型可准确预测湿地松松针提取物对酪氨酸酶的抑制效果。

2.2.2 交互拟合因素效应分析 提取温度、料液比、乙醇浓度3个因素之间的交互效应如图2所示。

由图2可知，当乙醇浓度为60%时，料液比与温度对酪氨酸酶抑制率的交互影响作用不明显；当料液比为1∶15时，乙醇浓度与温度对酪氨酸酶抑制率的交互影响作用极显著；当温度为80℃时，料液比与乙醇浓度对酪氨酸酶抑制率的交互影响明显。

2.2.3 验证试验 利用Design-Expert 8.05b软件进行最优化分析，以湿地松松针提取物对酪氨酸酶的抑制率为指标，确定最佳提取条件为：料液比1∶18，乙醇浓度54.04%，温度84.32℃，预测在此条件下，所得湿地松松针提取物对酪氨酸酶活性的抑制率为74.27%，提取物得率为21.43%。

考虑到实际情况，在验证试验中将最优提取条件调整为：料液比1∶18，乙醇浓度55%，浸提温度85℃。验证3次，测得湿地松松针提取物对酪氨酸酶的抑制率为70.67%±1.08%，与预测值间无显著差异，表明采用该模型优化的工艺参数具有可行性。

2.3 湿地松松针粗提物的酪氨酸酶抑制活性

测定不同质量浓度湿地松松针提取物对酪氨酸酶的抑制率，且与阳性对照熊果苷进行比较，结果如图3所示。

由图3可知，随着湿地松松针提取物、熊果苷质量浓度的增加，酪氨酸酶抑制率增加，二者的IC50值分别为 0.91，0.74 mg/mL。

3 结论

本研究通过单因素试验及3因素3水平响应面法分析，得到响应值与各因素间的数学模型。根据模型可知，各因素对提取结果的影响大小顺序为：提取温度＞乙醇浓度＞料液比。确定湿地松松针中酪氨酸酶抑制剂提取的最佳工艺参数为：料液比1∶18，乙醇浓度55%，温度85℃，提取液对酪氨酸酶的抑制率达70.67%。湿地松松针的提取物的得率为21.43%，对酪氨酸酶抑制率的IC50值为0.91 mg/mL。

本试验利用响应面分析法优化湿地松松针酪氨酸酶抑制剂提取的提取工艺，可为开发湿地松松针源酪氨酸酶抑制剂，并将其进一步应用于化妆品、食品和药物领域提供理论依据。

［1］李溯，丁劲松.黑色素生物合成与酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].中南药学，2013（4）：278-282.

［2］Kolbe L，Mann T，Gerwat W，et al.4-n-butylresorcinol，ahighly effectivetyrosinase inhibitor for thetopical treatment of hyperpigmentation[J].Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology，2013，27（S1）：19-23.

［3］Liang C，Lim JH.A synergistic tyrosinase inhibitor from the roots of Smilax china[J].Food Chemistry，2012，134（2）：1146-1148.

［4］Chang TS.An updated review of tyrosinase inhibitors[J].International Journal of Molecular Sciences，2009，10（6）：2440-2475.

［5］毕云枫.天然酪氨酸酶抑制剂的种类及其对酪氨酸酶抑制作用的研究进展[J].吉林大学学报：医学版，2014（2）：454-459.

［6］陈清西，林建峰，宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报：自然科学版，2007（2）：274-282.

［7］姚斌，沈晓兰，潘亚菊.α-熊果苷的研究进展[J].中国现代应用药学，2005，22（1）：32-33.

［8］Lin Y F，Hu Y H，Lin H T，et al.Inhibitory effects of propyl gallate on tyrosinase and its application in controlling pericarp browning of harvested longan fruits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（11）：2889-2895.

［9］李娜，鲁晓翔.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].食品工业科技，2010，31（7）：406-409.

［10］陈英，刘成国，赵毓芝，等.松针功能性成分及应用研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（10）：5994-5996.

［11］韩强，林惠芬，朱玲莉.几种中药提取物对酪氨酸酶活性的抑制[J].香料香精化妆品，1998，12（4）：22-24.

［12］刘锦梅，王艳丽，潘维.4种茶叶醇提物对酪氨酸酶的抑制作用[J].现代食品科技，2009，25（6）：610-616.

［13］栾庆祥，赵杨，周欣，等.单因素试验结合响应面分析法优化杜仲最佳提取工艺[J].药物分析杂志，2013（5）：859-865.

［14］余小翠，刘高峰.响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用[J].中药材，2010（10）：1651-1655.

［15］梁雪华，朱秀清，郑环宇，等.响应面法对大豆胰蛋白酶抑制剂粗提工艺的优化[J].食品科学，2011，32（4）：97-101.