MAPK信号通路对蟾蜍灵抑制Jurkat细胞增殖及诱导其凋亡的影响

杨 蕾，闫 红，董国凤，何 莉

0 引言

蟾蜍灵(Bufalin)是一种由中华大蟾蜍(Bufo gargarizans cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus schneider)的耳后腺或皮脂腺所分泌的白色浆液，经挤取、干燥、加工而成的中药制剂，在恶性肿瘤治疗中有广阔的应用前景[1]。蟾蜍灵有诱导白血病细胞凋亡及分化的作用[2]。蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制急性淋巴细胞白血病CEM细胞增殖、诱导凋亡[3]。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能将细胞外信号转导至细胞内及细胞核内，通过保守的三级级联反应(MAPKKK-MAPKK-MAPK)激活转录因子，调节基因表达及细胞的增殖、分化和凋亡[4]。近年来研究发现，MAPK信号通路在白血病细胞凋亡过程中发挥重要作用[5-7]，但蟾蜍灵通过MAPK通路诱导Jurkat细胞凋亡的研究还很少。本实验以Jurkat细胞为模型，观察ERK阻滞剂PD98059、JNK阻滞剂SP600125、p38MAPK阻滞剂SB203580在蟾蜍灵抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖及诱导其凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株，由中国医科大学中心实验室保存；蟾蜍灵购于Sigma公司，用无水乙醇配成1 mmol/L原液，-20 ℃贮存，实验前用PBS稀释，将乙醇终浓度控制在体积分数<0.01%，预实验表明，该浓度乙醇对细胞增殖没有影响；WST-1、PD98059、SP600125 及SB203580购自碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于凯基公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将Jurkat细胞株置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内传代培养。台盼蓝染色，拒染率大于95%为对数生长期细胞，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 WST-1法检测细胞增殖 实验分为单用5、10、20、40、80 nmol/L蟾蜍灵组；单用PD98059、SP600125、SB203580组；10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580分别预处理1 h后用20 nmol/L蟾蜍灵继续作用组，并设立阴性对照(未加药孔)及空白对照(无细胞孔)，每个样本设3个复孔。抑制率(%)=(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100%。抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)采用回归法计算。实验重复3次取平均值。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 实验分为单用20 nmol/L蟾蜍灵、10 μmol/L PD98059+20 nmol/L蟾蜍灵、20 μmol/L SP600125+20 nmol/L蟾蜍灵、10 μmol/LSB203580+20 nmol/L蟾蜍灵组，进行流式细胞术检测。实验重复3次取平均值。

2 结果

2.1 蟾蜍灵、PD98059、SP600125、SB203580单用及联合应用对Jurkat细胞增殖的影响

2.1.1 蟾蜍灵对Jurkat细胞增殖的抑制作用 5、10、20、40、80 nmol/L蟾蜍灵分别处理Jurkat细胞48 h，抑制率分别为13.42%±2.1%、25.05%±2.3%、30.42%±4.0%、37.18%±3.7%、41.35%±7.5%，蟾蜍灵对Jurkat细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性(P<0.05)，结果见表1。蟾蜍灵作用于Jurkat细胞48 h的IC50为44 nmol/L。

2.1.2 PD98059、SP600125、SB203580对Jurkat细胞增殖的抑制作用 10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580 分别处理Jurkat细胞48 h，对细胞增殖的抑制率分别为5.34%、6.54%和3.32%，不同浓度阻滞剂对细胞增殖无影响(P>0.05)。

表1 不同浓度蟾蜍灵对Jurkat细胞的抑制率

2.1.3 蟾蜍灵联合PD98059、SP600125、SB203580对Jurkat细胞增殖的抑制作用 10 μmol/L PD98059和20 μmol/L SP600125分别与20 nmol/L蟾蜍灵联合作用 Jurkat细胞48 h，其抑制率分别为49.14%±0.82%和47.05%±0.31%；与单用蟾蜍灵组相比细胞抑制率显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。10 μmol/L SB203580与20 nmol/L蟾蜍灵联合作用Jurkat细胞的抑制率为25.38%±0.62%，抑制率减低，与单用蟾蜍灵组比较差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

2.2 蟾蜍灵单用或联合PD98059、SP600125、SB203580对Jurkat细胞凋亡的影响 20 nmol/L蟾蜍灵作用Jurkat细胞48 h，细胞凋亡率为9.86%±0.14%。预先用10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580分别处理Jurkat细胞1 h后加入20 nmol/L蟾蜍灵继续作用48 h，细胞凋亡率分别为14.57%±0.26%、13.52%±0.43%和9.72%±0.05%。10 μmol/L PD98059和20 μmol/L SP600125分别与20 nmol/L蟾蜍灵联合作用，Jurkat细胞的凋亡率显著增加，与单用蟾蜍灵相比差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L SB203580与20 nmol/L蟾蜍灵联合作用，Jurkat细胞的凋亡率无明显改变(P>0.05)，结果见表2。

表2 蟾蜍灵联合阻滞剂对Jurkat细胞的抑制率和凋亡率

3 讨论

蟾蜍灵对髓系白血病细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用[2]。蟾蜍灵处理白血病细胞HL-60、ML-1、U937细胞后，可观察到细胞皱缩，凋亡小体及染色质碎裂凝集等凋亡形态学改变[8]。本实验室曾系统研究过蟾蜍灵对髓系白血病细胞HL-60、K562、NB4等细胞及急性淋巴白血病CEM细胞的作用，发现蟾蜍灵可诱导白血病细胞凋亡，从而发挥其抗癌作用，并证实在蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡过程中，同时上调或下调相关基因和蛋白的表达，如WT-l、Bcl-2、Survivin、BAX和Smac等[9-13]。另有实验表明，通过应用caspase阻断剂，发现蟾蜍灵通过内源性凋亡通路诱导人淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡[14]。以上多以髓系白血病细胞为主，蟾蜍灵是否通过MAPK通路诱导Jurkat细胞凋亡目前尚无文献报道，本研究将蟾蜍灵作用于急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞，实验结果表明，相同时间内随着蟾蜍灵浓度增加，OD值逐渐减少，说明蟾蜍灵能抑制白血病Jurkat细胞增殖，而且呈剂量依赖性，蟾蜍灵可诱导白血病Jurkat细胞凋亡。

MAPK是细胞内广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞反应的调节，如细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等[15]。每条信号通路都具有高度特异性，具有独立的功能。MAPKs家族主要通路包括：胞外信号调控激酶1/2通路(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶通路(JNK1/2)、P38丝裂原活化蛋白酶通路(P38)和ERK5通路，4条通路由独立的(有时重叠)信号级联激活。另外，还包括ERK3/4、ERK7/8和NLK通路等同样具有明显的调节功能。MAPK信号通路在白血病细胞凋亡过程中发挥重要作用。

ERK1/2通路主要调节细胞生长、生存，在一定条件下也可促进细胞的诱导分化。ERK1/2通路阻滞剂U0126和PD98059干扰ERK1/2通路，可协同化疗药物促进白血病细胞凋亡。研究表明，U0126和PD98059干扰ERK1/2通路，可增强2-氯-2′-脱氧腺苷对B系慢性淋巴白血病EHEB细胞的毒性作用[16]；PD98059阻断ERK1/2通路，可诱导慢性髓系白血病HL-60细胞凋亡，同时活化caspase-3[17]。PD98059协同蟾蜍灵诱导K562细胞凋亡，下调bcl-2蛋白表达[18]。本实验结果表明，PD98059和蟾蜍灵联合作用于Jurkat细胞，其增殖抑制率和凋亡率分别为49.14%±0.82%、14.57%±0.26%，与单独应用蟾蜍灵相比，对Jurkat细胞增殖抑制率和凋亡率均显著增加，差异具有统计学意义。表明PD98059干扰ERK1/2通路可协同蟾蜍灵抑制Jurkat细胞增殖、诱导其凋亡。

JNK1/2通路多在应激条件下激活，主要介导前凋亡信号、生长抑制信号和炎性反应，JNK1/2通路阻滞剂SP600125可阻断JNK1/2通路。Torres等[19]指出，SP600125可显著诱导白血病细胞凋亡，下调IL-18的表达，从而诱导ULBP2蛋白表达水平，且呈剂量依赖性。本实验结果表明，SP600125和蟾蜍灵联合作用于Jurkat细胞，其增殖抑制率和凋亡率分别为47.05%±0.31%、13.52%±0.43%，与单独应用蟾蜍灵组相比，对Jurkat细胞增殖抑制率和凋亡率均显著增加，其差异均有统计学意义。表明SP600125干扰JNK1/2通路可协同蟾蜍灵抑制Jurkat细胞增殖、诱导其凋亡。

p38通路同JNK1/2通路一样多在应激条件下激活，在一定条件下，p38通路也可诱导抗细胞凋亡、促进细胞增生和细胞生存信号，这有赖于所涉及的组织和参与的p38亚型。Hirosawa等[20]发现，p38MAPK阻滞剂SB202190可促进急性单核细胞白血病THP-1及MV4-11细胞生长，同时增加磷酸化C-Raf表达。Chen等[21]应用高压氧处理急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞，表现出显著的细胞凋亡，细胞内p38磷酸化水平显著上调。本实验结果提示，SB203580 联合蟾蜍灵作用于Jurkat细胞，与单独应用蟾蜍灵组比较，可显著抑制细胞增殖，但对其凋亡无影响。

本实验对蟾蜍灵通过MAPK通路诱导Jurkat细胞凋亡进行初步探讨，结果表明，MAPK信号通路与蟾蜍灵抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat 细胞增殖及诱导其凋亡有相关性。表现为ERK和JNK通路促进增殖、抑制细胞凋亡；p38MAPK抑制增殖，但对凋亡无明显影响。

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