硫化氢对老龄急性脑梗死大鼠海马神经元腺苷酸活化蛋白激酶和星形胶质细胞的影响

郭丹丹，章以杰*，刘志成，常国江，林 俊，田苗苗，宋晓丽，王 彬

0 引言

急性脑梗死是老年人的常见病之一，除了出现偏瘫、失语、吞咽困难等症状外，还可出现认知功能障碍等症状，进一步影响了患者的生活和工作质量。有研究显示，认知功能障碍是急性脑梗死幸存者最常见的并发症之一，急性脑梗死后1周时，认知功能障碍的发生率为61%，6个月时仍有37%的患者遗留认知功能障碍[1]。因此，在脑梗死早期，如何治疗患者认知功能障碍，改善患者生活质量是近年来临床研究的热点。硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3种气体信号分子。近年来，该分子在哺乳动物各系统发挥的生理和病理调节作用越来越受到人们的重视，大量研究表明，外源性H2S能改善癫疒间大鼠的学习记忆能力[2]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞和全身最重要的维持能量平衡的物质[3]。有研究显示，海马AMPK水平升高是老龄大鼠脾切除术后认知功能障碍形成时机体的适应性调节机制[4]。星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统内数量最多、分布最广、体积最大的一类神经细胞。研究显示，老年患者由于星形胶质细胞合成和分泌能力下降，对神经元的支持营养能力也相应下降，同时，对Aβ摄取和降解的能力也下降，而手术创伤可能加重这种退行性改变，从而导致脑功能障碍，引起认知功能下降[5]。本研究拟评价硫化氢对老龄急性脑梗死大鼠海马神经元腺苷酸活化蛋白激酶和星形胶质细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性老龄SD大鼠96只(长沙市药物检验检疫局提供)，体质量450～550 g，采用随机数字表法，将其随机分为4组：对照组(C组)、模型组(O组)、生理盐水+模型组(S组)、H2S组+模型组(H组)，每组24只。参照文献[6]采用线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞致急性脑梗死模型。H组于制作模型前25 min给予大鼠腹腔注射H2S外源性供体NaHS(14 μmol/kg)；S组于制作模型前25 min给予大鼠腹腔注射注入等量的生理盐水；C组不行任何处理。

1.2 方法 采用Morris水迷宫测试大鼠，在制备模型前5 d开始Morris水迷宫学习，每天于同一时间段进行，剔除有明显运动障碍的大鼠。测试用圆形水池直径，120 cm，高40 cm；圆柱形平台，直径10 cm，高30 cm。室温及水温均保持在24～26 ℃。第1～4天每天从东、南、西、北4个等距离点中选一点将动物面向池壁放入，其游泳图像经水面上方2 m处摄像机拍摄并连接于路径追踪系统进行采集。训练前将老年大鼠先放于平台20 s，再面对池壁放入迷宫，每次游泳时限为90 s，在90 s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为90 s，由测试者引导其上台，休息20 s后进行下一次训练。在第5天每一点连续训练2次，用平均成绩作为术前成绩。测试完成后，各组大鼠进行相应处理，于制备模型前第5天(T)用与制备模型后1、3、5 d(T1、T3、T5)测试相同的方法进行行为学测定。选用逃避潜伏期和游泳路径作为大鼠学习和记忆测试的指标。

采用RT-PCR法测定大鼠海马内AMPK mRNA的表达，于制备模型后1、3、5 d水迷宫测试结束后，随机从各组取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，迅速置于冰上断头取脑，分离海马组织，-80 ℃冰箱保存。海马组织RNA的提取，采用RNA提取试剂盒法(天根公司，北京中国)。取RNA产物1.0 μg，用逆转录试剂盒(天根公司，北京中国)反转录合成cDNA；引物设计：AMPK-α上游5′-GCTGTGGATCGCCAAATTAT-3′和下游5′-GCATCAGCAGAGTGGCAATA-3′共222 bp。内参选用β-actin：上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′和下游5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′rt-PCR采用rt-PCR试剂盒(天根公司，北京中国)，反应条件都是：第一步：预变性95 ℃ 5 min；第二步：变性95 ℃ 20 s，退火56 ℃ 20 s，延伸75 ℃ 30 s，40循环；第三步：75 ℃ 7 min。得到扩增曲线和溶解曲线。采用Western-blot法测定大鼠海马内AMPK、p-AMPK的表达：海马组织加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF(碧云天生物试剂研究所，中国)进行冰上裂解2 h后，超声裂解、低温离心取上清液95 ℃变性5 min，放入-20 ℃冻存。检测p-AMPK指标的组织裂解时，另需加入磷酸酶抑制剂(碧云天生物技术研究所，中国)。选用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至PVDF膜(Millipore公司，美国)，加一抗，置于摇床上(Thermo公司，美国)室温孵育2 h，PBST充分漂洗后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶6 000,北京中杉金桥科技公司)室温摇床孵育1 h，膜与化学发光底物孵育后显影照相。图像用Quantity one 图像分析软件(Bio Rad公司，美国)测定AMPK、p-AMPK的表达。

采用免疫组织化学法计数GFAP阳性细胞总个数[7]。将rt-PCR剩余的海马组织化冻后，进行福尔马林固定，脱水，石蜡包埋切片，脱蜡用二甲苯脱蜡3次，每次5 min；水化用无水乙醇2次，每次3 min，95%的酒精2次，每次3 min，85%的酒精1次，每次3 min。自来水冲洗20 s；PBS液洗涤4次，每次4 min；1∶100的柠檬酸高压锅开盖沸腾后，放入切片，盖锅盖高压维持3 min进行修复；PBS洗涤4次，每次4 min；双氧水1滴滴在切片有组织处，并完全盖住组织进行灭内菌酶10 min；PBS洗涤4次，每次4 min；加入1∶100的一抗胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体一滴滴在有组织处，并完全盖住组织，放入37 ℃温箱中卵巢育1 h；PBS洗涤4次，每次4 min，加二抗羊血清一滴在组织处并完全盖过组织，室温下卵巢育20 min；PBS洗涤4次，每次4 min；加显影剂2 min，观察胞浆染色出现褐色沉着后，迅速用自来水冲洗停止显影；苏木素染色5 s；自来水冲洗；85%酒精3 min，95%酒精3 min；无水乙醇3 min，二甲苯脱水2次，每次3 min，用凝胶封片晾干保存。选取10个在高倍镜下较清晰且无视野缺损的视野，计数GFAP阳性细胞总个数。

2 结果

与C组比较，O组、S组、H组大鼠逃避潜伏期和游泳路径延长(P<0.05)；与O组、S组比较，H组大鼠逃避潜伏期和游泳路径缩短(P<0.05);与制备模型前比较，O组、S组、H组制备模型后1、3、5 d大鼠逃避潜伏期和游泳路径延长(P<0.05);制备模型前各组、O组与S组大鼠逃避潜伏期和游泳路径比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 四组大鼠各时点逃避潜伏期和游泳路径的比较

与C组比较，O组、S组、H组大鼠海马AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表达上调(P<0.05);与O组、S组比较，H组大鼠海马AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表达下调(P<0.05);O组与S组大鼠海马AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

与C组比较，O组、S组、H组大鼠海马GFAP表达细胞数量增多(P<0.05);与O组、S组比较，H组大鼠海马GFAP表达细胞数量减少(P<0.05);O组与S组大鼠海马GFAP表达细胞数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。四组大鼠T1、T3、T5时，海马GFAP阳性神经元见图1～图3。

表2 四组大鼠各时点海马AMPK mRNA、AMPK和p-AMPK表达水平比较

3 讨论

参照文献[8]选择腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)。Morris水迷宫实验是评价啮齿类动物空间学习记忆功能的经典方法，其定位航行实验中的逃避潜伏期可反映获取空间信息记忆能力；空间探索实验中游泳路径反映获取空间信息的记忆存储能力。本研究参照文献[9]制备大鼠模型，结果表明，与C组比较，O组逃避潜伏期和游泳路径延长，提示老龄大鼠出现了认知功能障碍，表明老龄急性脑梗死大鼠认知功能障碍模型制备成功。

表3 四组大鼠各时点海马GFAP表达细胞数量比较

图1 四组大鼠T1时海马GFAP阳性神经元

图2 四组大鼠T3时海马GFAP阳性神经元

图3 四组大鼠T5时海马GFAP阳性神经元

海马是掌管认知功能的重要区域。血脑屏障作为中枢神经系统和外周血液循环的屏障，能防止循环血液中的大多数大分子物质通过，保护海马组织不受损伤。研究表明，星形胶质细胞激活后可导致血脑屏障通透性的改变，而外周炎性反应可以直接通过血脑屏障进入中枢对海马造成损害[10]。GFAP是星形胶质细胞内的重要蛋白，激活的星形胶质细胞表达GFAP明显增多，因此，GFAP是AS星形胶质细胞激活的标志。AMPK是由催化亚基α、调节亚基β和γ组成的异源三聚体，其中α1、α2亚基广泛存在于大脑[11]。认知功能障碍的病理特征主要是海马区域神经元微管相关蛋白tau 的过度磷酸化[12]。研究表明，AMPK可通过调控tau蛋白磷酸化，参与AD的发生和发展[13]。

本研究结果表明，老龄大鼠急性脑梗死后1、3、5 d逃避潜伏期和游泳路径延长，海马AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表达上调，GFAP表达细胞数量增多，提示急性脑梗死后，可造成老龄大鼠认知功能障碍；而H组较O组急性脑梗死后1、3、5 d逃避潜伏期和游泳路径缩短，海马AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表达下调，GFAP表达细胞数量减少，提示H2S可改善老龄大鼠术后认知功能障碍，其机制可能是：急性脑梗死后可引起炎症反应，从而导致星形胶质细胞作为神经免疫细胞被激活[14]，而H2S可抑制LPS诱导的RAW26417巨噬细胞NO的产生和NF-κB的表达,从而调节细胞内炎症介质的释放,发挥抗炎症的功能[15]，抑制星形胶质细胞的激活。此外，H2S可通过调节脑血管壁平滑肌张力来调节大脑血供，进而间接影响中枢神经系统功能[16-18]，从而使 ATP/AMP比例增加，抑制AMPK磷酸化和AMPK的激活，减少tau蛋白磷酸化[19]，改善认知功能障碍。

综上所述，H2S可通过下调海马神经元腺苷酸活化蛋白激酶和抑制星形胶质细胞激活，改善老龄急性脑梗死大鼠认知功能，为临床上急性脑梗死后认知功能障碍的治疗提供了新思路。

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