甲磺酸伊马替尼增加顺铂对耐药卵巢癌细胞作用的研究

张 阔，陈 燕

0 引言

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤，其中上皮性癌占卵巢癌的90%，因为卵巢深居盆腔，常因发现晚、播散快而严重影响患者的预后。目前，卵巢癌的治疗方案为手术联合化疗。肿瘤减灭术后和不能耐受手术的患者都需要通过化疗来提高患者的生存率，铂类的初始化疗对绝大部分患者有效，但这些患者会出现复发和耐药，因此，对化疗药物耐药成为治疗中最棘手的问题。以铂类为代表的临床一线化疗药有消化道反应和肾毒性，并且随着浓度的增大，毒性反应更加明显。因此，寻找治疗效果好，毒副作用小，并能提高卵巢癌对化疗药物敏感性的药物和治疗方案迫在眉睫[1]。分子靶向药物是利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异(包括基因、酶、信号转导等不同特性)，抑制肿瘤细胞增殖，最后使其死亡。近年研究发现，分子靶向治疗药物与传统药物相比，毒副作用小，无须最大耐受剂量即可获得较好的临床疗效，也可以为一些耐药肿瘤的治疗提供新的方案，受到广泛关注。甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)是分子靶向药物的一种，属于酪氨酸激酶受体抑制剂。有研究表明，该药物特异性靶向3种受体，分别是 Bcr-Abl酪氨酸激酶、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子(c-Kit)，可以通过阻止酪氨酸激酶受体自身的磷酸化，影响细胞信号转导，破坏细胞周期进程，从而影响肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡[2]。本研究以其中的耐药卵巢癌细胞系SKOV3/DDP为研究对象，从细胞增殖、凋亡等方面探讨甲磺酸伊马替尼对卵巢癌耐药细胞体外培养的影响，以及其对细胞耐药的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SKOV3细胞株(人卵巢浆液性囊腺癌细胞株)由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供；甲磺酸伊马替尼，大连美仑生物技术有限公司；顺铂(DDP)，山东罗欣药业有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、RNA酶、胰蛋白酶，Sigma公司；PRMI-1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；AnnexinV-EGFP 细胞凋亡检测试剂盒，联科生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SKOV3细胞株在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素RPMI-1640培养基中，37 ℃、5%CO2混合气体的培养箱中培养，细胞换液为24～48 h，待细胞铺满瓶底80%～90%时，0.25%胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验，采用顺铂中等浓度、间歇作用方法建立SKOV3/DDP细胞株。

1.2.2 MTT法检测不同浓度的甲磺酸伊马替尼、DDP单用药以及联合用药对人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP的增殖抑制情况 MTT法测定：取对数生长期的SKOV3/DDP细胞，胰酶进行消化，制成单细胞悬液，进行细胞计数，按照母孔1×104个/200 μL的细胞数接种于96孔板中的细胞分别培养24 h后，倒置像差显微镜下观察，选择细胞贴壁生长状态良好的进行试验。药物处理组根据药物不同分为以下3组：甲磺酸伊马替尼组，终浓度分为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L；DDP组，终浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg/L；联合组，终浓度甲磺酸伊马替尼5.0 μmol/L分别与DDP 5.0、10.0、20.0 mg/L联用，两药合用的比例为1∶1。加药后继续培养。每个浓度设4个平行复孔，设调零孔为空白对照组(OD值为0)。甲磺酸伊马替尼单药作用24、48、72 h不同的时间点，DDP单药组以及联合用药组作用48 h。终止培养，避光操作下，每孔加入配好的5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃孵箱内避光孵育4 h，吸弃培养基终止培养。每孔加入DMSO 150 μL，室温下震荡器低速震荡15 min。在酶标仪上选择波长为595 nm，测定细胞的吸光度(OD)值，实验重复3次。

计算出SKOV3/DDP的耐药指数以及甲磺酸伊马替尼、DDP单药及联合用药对SKOV3/DDP细胞株的生长抑制率及IC50值、DDP的耐药逆转倍数。公式：(1)细胞生长抑制率=[1-(用药组OD值-调零孔OD值)/(无药组OD值-调零孔OD值)]×100%；(2)IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]；(3)耐药指数=SKOV3/DDP的IC50/SKOV3的IC50。

1.2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡率 取对数生长期的SKOV3/DDP细胞，调整细胞浓度为1×106/mL接种于25 cm2培养瓶中，在37 ℃、5%CO2培育箱中培养24 h后换液。实验组分3组：单用DDP组，浓度5 mg/L；单用甲磺酸伊马替尼组，浓度5 μmol/L；联合用药组终浓度DDP 10 mg/L和甲磺酸伊马替尼5 μmol/L；给药24 h后收集细胞，离心、PBS洗涤，加入结合缓冲液(Binding buffer)悬浮细胞，加入annexinV-FITC 5 μL轻轻混匀，室温避光孵育，10 min后1 000 r离心5 min，弃上清，加入annexinV-FITC的结合缓冲液190 μL轻轻重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶(PI)，冰浴避光放置。流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况。

2 实验结果

2.1 通过诱导耐药建立SKOV3/DDP 细胞株，计算出DDP对于SKOV3/DDP细胞及SKOV3细胞的IC50值分别为(39.57±0.98)mg/L和(9.81±0.07)mg/L，其耐药指数约为4.03。

2.2 采用MTT法检测甲磺酸伊马替尼、DDP单药及联合用药时对SKOV3/DDP细胞生长的影响

2.2.1 MTT法检测出不同药物浓度的甲磺酸伊马替尼作用于SKOV3/DDP细胞呈现出不同程度的细胞生长抑制作用，随药物浓度的增高、作用时间的延长对细胞的增殖抑制作用增强，甲磺酸伊马替尼在5.0 μmol/L作用48 h细胞生长抑制率约为30%，故选用此药物浓度组作为后续实验的药物浓度。

表1 甲磺酸伊马替尼作用于SKOV3/DDP细胞不同作用时间生长抑制率变化

2.2.2 甲磺酸伊马替尼与DDP两药联合应用对SKOV3/DDP细胞增殖的影响 依据DDP单药对SKOV3/DDP作用的结果，选择对细胞生长抑制率小于50%的3个DDP浓度：5、10、20 mg/L，依据表1选择甲磺酸伊马替尼剂量浓度为5.0 μmol/L，二者联合作用于SKOV3/DDP细胞48 h，计算生长抑制率。由表2可见，两药联合用药组对细胞生长抑制率分别为(38.63±1.31)%、(51.55±1.20)%、(66.54±1.23)%，明显高于DDP单用药组的(8.30±0.85)%、(16.68±1.69)%、(30.83±1.78)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。由此计算出两药合用后的IC50=39.57±0.13，显著高于单用顺铂的9.57±0.13，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，DDP的药物敏感性增加4.13倍，见表3。

表2 甲磺酸伊马替尼与不同浓度DDP联合作用于SKOV3/DDP细胞的生长抑制率

表3 甲磺酸伊马替尼与DDP联合对SKOV3/DDP细胞的影响

2.3 流式细胞仪检测甲磺酸伊马替尼、DDP单独及联合应用对SKOV3/DDP凋亡的影响 由表4可以看出，对照组、DDP单用药组、甲磺酸伊马替尼单用药组的早期凋亡率分别为0.63%、1.25%、4.57%，各单独用药组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，联合用药组的凋亡率为12.31%，明显较其他单独用药组增高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明甲磺酸伊马替尼可通过诱导耐药细胞的凋亡从而增强对DDP的敏感性。

表4 甲磺酸伊马替尼、DDP单独及联合应用对细胞凋亡的影响

3 讨论

卵巢癌在女性生殖道肿瘤的发病率中居第3位，但死亡率最高，传统的治疗方法为在肿瘤细胞减灭术的基础上联合药物(铂类和紫杉醇为主)化疗，但最终大多患者会复发。复发后存活时间一般少于3 年[3]。一方面由于70%的患者在确诊时已经处于晚期，另一方面由于化疗耐药，致使预后更差。近年来发现，卵巢癌患者常常伴有外周血小板增多，而且血小板增多预示着不良结局[4]，提示抗血小板治疗可能是一项有效的治疗措施。血小板增多导致血小板衍生因子(PDGF)释放增多。而PDGF 受体(PDGFR)是肿瘤进展和转移的重要因素，其过表达与肿瘤的耐药有关[5]。首先，卵巢肿瘤存在一种旁分泌通路，能增加PDGF释放[6]，并且发现卵巢癌可检测到PDGFR的高水平表达[7]。这种旁分泌方式PDGFR的表达以及表达量的高低是一些肿瘤细胞增殖的限速步骤[8]，PDGFR表达越高，肿瘤细胞增殖越快。并且PDGF和PDGFR的结合及信号通路的激活可增加肿瘤基质的组织间液体压(Interstitial fluid pressure，IFP)[9]，从而阻碍抗肿瘤药物有效运输到肿瘤，减少了肿瘤组织对药物的摄取，从而使肿瘤细胞逃逸被杀或死亡[10]，导致肿瘤的耐药。PDGFR抑制剂可正常化IFP，从而增加抗肿瘤药物的疗效。

分子靶向药物—甲磺酸伊马替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，可以靶向PDGFR，此药以细胞信号传导的特异分子为靶点，通过竞争结合ATP位点，特异地阻止酪氨酸激酶受体自身磷酸化，影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡[11]。甲磺酸伊马替尼开始用于治疗慢性髓性白血病(CML)，后来用于胃肠道肿瘤的治疗，效果显著[12]。近几年应用于小细胞肺癌、皮肤癌、神经胶质瘤、乳腺癌等方面的研究较多[13]，国外学者在卵巢癌方面也进行了较多的研究，结果发现，对至少表达1种伊马替尼靶向受体c-kit、c-abl、PDGFR的铂类耐药和紫杉醇耐药的复发卵巢癌患者单一应用伊马替尼治疗，这些患者都能较好地耐受伊马替尼，但并没有明显的临床疗效[14-15]。本实验将甲磺酸伊马替尼及顺铂联用，观察其对卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对DDP耐药的逆转作用。研究表明，甲磺酸伊马替尼单独应用，增殖抑制率随着各自浓度及时间的增加而增加，各组与对照组之间差异显著；与DDP联合应用，各组与单独用药组相比，差异有统计学意义，且甲磺酸伊马替尼可以逆转卵巢癌细胞对DDP耐药。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示：两药联合组的细胞凋亡率明显高于单药组，说明甲磺酸伊马替尼与顺铂具有协同作用，能促进细胞凋亡，增加对DDP的敏感性。

综上所述，本实验采用联合用药的方法进行实验，发现PDGFR抑制剂—甲磺酸伊马替尼作为新一代抗肿瘤药，能有效抑制卵巢癌细胞的增殖，同时能够在一定程度上逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性。为临床卵巢癌的化疗提供了新的参考方法。甲磺酸伊马替尼还可以靶向c-kit、c-abl两种受体，通过除PDGFR以外的其他途径发挥作用，有待于其他实验进行进一步的探索。

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