HPLC-ELSD法同时测定复方三七漱口液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1的含量

王 莹，贺文娟，顾 宜，成黎霏，王晓娟

0 引言

复方三七漱口液收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》2002年版[1]。由三七和醋酸氯己定组成，具有散瘀止血、消肿定痛的功效，用于口腔炎、牙周炎、牙周肿痛、咽喉痛、牙龈出血等常见病的防治。三七中主要含三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1[2]，原标准只对三七中人参皂苷Rb1进行了薄层鉴别，未对三七中的专属性成分三七皂苷R1及人参皂苷Rg1进行鉴别和含量测定，不能有效控制该制剂的质量。目前文献报道中关于三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的测定多采用HPLC-UV法[3-6]，亦有采用HPLC-ELSD法[7-9]。因皂苷类成分的紫外吸收均为末端吸收，使用HPLC-UV法时基线易漂移，且灵敏度低，故本试验选用HPLC-ELSD法测定复方三七漱口液中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；DL-720超声仪(浙江石浦海天电子仪器厂)；BT125D分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药 复方三七漱口液(200 mL/瓶，批号：130723、130804、130810，第四军医大学口腔医院药剂科)；对照品三七皂苷R1(批号：110745-200617，纯度大于98%)，人参皂苷Rg1(批号：110703-201027，纯度为96.3%)，人参皂苷Rb1(批号：110704-201223，纯度为95.9%)，均购自于中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇[色谱纯，购于霍尼韦尔贸易(上海)有限公司]；水为实验室自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别[1-2,11-12]

2.1.1 供试品溶液 取10 mL复方三七漱口液，加10 mL饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，加3倍正丁醇饱和的水，放置分层，取正丁醇层，水浴蒸干，加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 对照药材溶液 取0.5 g三七粉，加水5滴，再加水饱和的正丁醇5 mL，振摇10 min，放2 h，取上清液，加3倍正丁醇饱和的水，放置分层，取正丁醇层，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。

2.1.3 对照品溶液 称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，分别制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液 按处方比例，制成不含三七提取液的阴性药，按“2.1.1”项下制备，作为阴性对照溶液。

2.1.5 薄层展开 照薄层色谱法试验，吸取以上溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)置于10 ℃以下，放置12 h，取下层溶液作为层析液，展开，预饱和30 min，展距10 cm，喷以10%硫酸乙醇，105 ℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。见图1。

图1 复方三七漱口液薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 溶液的配制 a.混合对照品溶液：精密称取适量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，分别制成每1 mL含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1分别为0.1 mg、0.4 mg和0.4 mg的溶液，即为混合对照品溶液。b.供试品溶液：取本品一瓶超声20 min，精密量取5 mL，加甲醇稀释溶解至10 mL，即得。c.阴性样品溶液：按处方比例，制成不含三七提取液的阴性药，按“供试品溶液”制备，即得。

2.2.2 色谱条件 色谱柱：DIKMA Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水梯度洗脱；流速：1 mL/min；柱温为30 ℃；蒸发光散射检测器漂移管温度47 ℃，载气流速1.5 L/min。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 方法学考察 专属性：分别精密吸取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1标准溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图2。结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1与其他组分峰的分离度均大于1.5，阴性对照溶液在相应保留时间内未出现色谱峰，表明阴性对照溶液无干扰，专属性强。

标准曲线：精密吸取混合对照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，注入液相色谱仪，以进样质量的对数为横坐标(X)、峰面积的对数为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表2。

表2 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的线性关系

稳定性：精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.96%、1.43%和1.97%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

精密度：分别精密吸取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的混合对照品溶液10 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，连续测定6次。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.75%、1.83%和1.88%，表明精密度良好。

重复性：取同一批号(130723)的复方三七漱口液，按“2.2.1”项下供试品溶液的制备平行制备供试品6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为1.80%、1.77%和2.00%，表明该方法重复性良好。

图2 高效液相色谱图

加样回收率：精密量取已知含量的样品(批号：130723，三七皂苷R10.06 mg/mL，人参皂苷Rg10.25 mg/mL，人参皂苷Rb10.20 mg/mL)5 mL，共9份，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，按“2.2.1”项下供试品溶液的制备制成低、中、高三种浓度，每组3份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=9)

2.2.4 样品含量测定 取3个批号(130723、130804、130810)的复方三七漱口液，分别按照“2.2.1”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，取供试品溶液和混合对照品溶液适量，按照“2.2.2”项下条件进样，记录峰面积，按照外标两点对数法计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量，见表4。

表4 样品含量测定结果(mg/mL)

3 讨论

在预试验阶段，参照中国药典2010版一部中三七项下皂苷类化合物的测定方法，采用HPLC-UV法对复方三七漱口液中的三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1进行测定，结果发现基线漂移严重，各指标成分分离较差；而蒸发光散射检测器(ELSD)是一种质量型检测器，其响应与被测物质的质量相关而不依赖于被测物的光学性质，所以在选用ELSD作为检测器进行检测时，基线平稳，色谱峰峰形较好，分离度好。

复方三七漱口液中三七皂苷R1含量较少，参考2010版中国药典中三七药材的处理方法，对复方三七漱口液用饱和正丁醇萃取3次，使三七皂苷R1更多地被提取，使TLC鉴别现象更明显；所建立的HPLC-ELSD法避免了HPLC-UV法基线漂移、分离度差的问题，较其他的HPLC-ELSD法所用分析时间更短[8-10]。通过运用本实验建立的HPLC-ELSD法对三批制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量进行测定，结果表明，该方法简便、稳定、可靠，可更好地控制复方三七漱口液的质量

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