表观遗传学与糖尿病肾病的研究进展①

吕俊，高家林，王李卓

（皖南医学院生物化学教研室，皖南医学院附属弋矶山医院内分泌科，安徽 芜湖 241002 E－mail：2802654657＠qq.com）

遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等。表观遗传学（epigenetics）这一概念最早在1942年由康拉德·哈尔·沃丁顿提出，认为基因型通过一些偶然的、不确定的机制决定了不同的表型，并指出表观遗传与遗传是相对的。主要研究基因型和表型的关系。几十年后，霍利迪对这个内容作了补充和完善。即表观遗传学是基因的DNA序列不发生改变的前提下，基因的表达水平和功能发生改变，并产生可以遗传的表型。主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA干扰等。其与肿瘤、糖尿病、心血管、代谢综合征等多种疾病的发生发展有关。

糖尿病是世界第三大慢性疾病，严重危害着人类健康。随着经济的发展和人均寿命的延长，我国糖尿病的患病率正在急剧增高，预计到2025年，我国糖尿病患者总数可能达到1亿人左右。糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症。其发生率可达20%～50%之多。糖尿病肾病是糖尿病患者高死亡率的重要原因之一［1］。值得注意的是糖毒作用后即使血糖控制在正常范围，糖尿病肾脏的病变依然持续进展，而早期强化血糖控制则可产生持久的效益，这一现象被称为“代谢记忆”［2］或者“遗留效应”［3］。

正常情况下，肾小球细胞外基质（ECM）的合成及降解与肾小球毛细血管丛的再生及修复保持一种高度协调，它受各种细胞因子、蛋白酶及抑制因子的调控，是一个复杂的过程。任何一个环节的细微变化均可导致肾小球中ECM的合成与降解失衡从而出现肾小球基质膜的破坏和ECM的堆积，导致肾小球的硬化。肾小球硬化是肾小球损伤的结局，而高血糖无疑是上述病变形成的始动因素之一。糖尿病肾病相关基因的发现及其功能的阐明将为糖尿病肾病的早期诊断、基因治疗提供有效的手段。即使血糖控制在理想状态下，其炎症仍能持续发生，间质化继续加重。提示存在“代谢记忆”，有研究指出可从表观遗传学水平阐明其发病机制。

1 DNA甲基化、去甲基化

1.1 DNA甲基化 是目前研究最为深入的表观遗传学机制之一［4］，它是指S－腺苷甲硫氨酸（SAM）脱去1个甲基转变为S－腺苷同型半胱氨酸（SAH），同时将该甲基转运至胞嘧啶－鸟嘧啶（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子（c）上，修饰为5－甲基胞嘧啶（5－mC）。CpG二核苷酸在基因组中出现的频率较低，但在特定区域，如基因启动子区，CpG二核苷酸密集存在，可高达60%～70%，发挥调控基因转录作用。DNA甲基化需在DNA甲基转移酶的催化下进行。

DNA发生甲基化后，可以通过以下三个方面直接或者间接影响该基因的表达［5］：①通过阻断转录起始因子与启动子的结合直接抑制基因转录；②可招募甲基化CpG结合蛋白（methyl－CpG－binding proteins，MBPs），其与5－甲基胞嘧啶结合后，将进一步阻碍转录起始因子与启动子结合；③还可招募组蛋白去乙酰化酶形成复合物，使组蛋白去乙酰化，导致染色质聚缩成非活性致密结构，间接抑制基因转录，参与x染色体沉默、基因印迹、组织特异性基因表达等生理过程。

1.2 DNA去甲基化 是5－甲基胞嘧啶经过一系列反应被胞嘧啶所取代的过程。长期以来，一直认为去甲基化主要发生在DNA复制过程中，是一个被动的过程，然而目前，有关DNA主动去甲基化的机制被提出［6］。

2 组蛋白修饰

组蛋白修饰是表观遗传学中的另外一项重要的内容。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质［7］。在真核生物体内，DNA以环状超螺旋形式围绕在4种核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）周围组成核小体，是染色质的基本单位。组蛋白H1结合于核小体间的连接DNA（1inker DNA）上，使核小体成串排列，形成串珠样结构。组蛋白有两个活性末端：即羧基端和氨基端。

核心组蛋白的N末端在物种之间十分保守且易发生各种类型转录后修饰，这种常见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，它们都是组蛋白密码的基本元素。该结构不仅利于压缩和保护DNA，而且可以保存遗传信息和控制基因表达［8］。修饰后的残基通过两种途径影响基因的功能，一是通过改变构像或者改变组蛋白电荷而影响核小体－核小体或DNA－核小体相互作用。从而改变染色质的疏松或者凝集状态；二是形成靶点，招募特定蛋白质影响转录过程。

2.1 组蛋白甲基化 主要发生在赖氨酸和精氨酸侧链的氮原子上，其中赖氨酸的甲基化被认为是具有稳定性和遗传性。由甲基转移酶和去甲基酶催化完成。甲基转移酶主要有三个蛋白家族：蛋白质精氨酸甲基转移酶家族、SET家族和非SET家族［9］。组蛋白赖氨酸甲基化主要发生在H3和H4上。组蛋白精氨酸的甲基化和基因的激活密切相关［10－11］。而 H3、H4精氨酸的去甲基化则可能导致基因沉默。甲基转移酶和去甲基转移酶可以逆转调节组蛋白的甲基化过程，对基因的表达起着决定性的作用［12］。譬如：转甲基酶set7／9可能与RNA聚合酶II相互作用共同调节胰岛β细胞的基因表达；赖氨酸4和赖氨酸36发生的组蛋白H3甲基化，常使常染色质结构疏松伴随转录能力的增强，但是赖氨酸9和27发生的组蛋白H3的甲基化则使染色体的结构致密，并伴随有基因的沉默［13］。

2.2 组蛋白的乙酰化 组蛋白的乙酰化主要发生在H3和H4的N端的赖氨酸位点上，主要由乙酰转移酶和去乙酰转移酶协调进行。乙酰转移酶可以使组蛋白赖氨酸的相关位点乙酰化减弱组蛋白和DNA结合的能力，促进转录。去乙酰化酶可以使组蛋白去乙酰化增强组蛋白与DNA结合能力，抑制转录。譬如赖氨酸残基的乙酰化也是目前了解的比较清楚的一个过程［14］，乙酰化后的DNA结构变得松散使转录因子易于结合上去，这一过程往往伴随DNA的转录活化［15］，这一修饰过程同时又可以被组蛋白去乙酰化酶所逆转。这些修饰作用由修饰位点和修饰程度所决定，或互相协同或互相拮抗，动态调节基因表达。

3 糖尿病肾病与表观遗传修饰

无论1型还是2型糖尿病都可显著加速微血管的病变从而引发并发症如糖尿病肾病。涉及其中的主要事件包括免疫调控炎症因子的表达，糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）的生成，多元醇和氨基己糖代谢途径及PKC信号转导通路的激活等［16－17］。Wren等［18］通过 Data－Mining分析罗列了引起糖尿病及其并发症的诸多因素，结果发现“甲基化”和“染色质”的统计得分最高，表明机体的表观遗传修饰是糖尿病发生发展的重要原因。

3.1 DNA甲基化与糖尿病肾病 表观遗传因素在基因和环境之间起到调节作用，并影响糖尿病及其并发症。Bell等［19］测定了两组高加索人外周血甲基化水平（分别为糖尿病组和正常组），发现两组的DNA甲基化水平有着明显的差异。也有研究表明DNA甲基化修饰可能是糖尿病的早期事件。最新研究对唾液中提取的DNA基因进行甲基化水平测定，发现糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）不同的发展阶段 DNA 的甲基化差异显著，根据DN的发展阶段分成两组，一组是糖尿病终末期肾病与另外一组是无肾脏并发症的糖尿病患者组。发现此两组至少有两个CpG位点的甲基化存在着明显的差异［20］。有学者进一步指出糖尿病大鼠肾组织内CpG二核苷酸C碱基处的DNA甲基化模式发生改变，并伴随DNA甲基化酶、RNA聚合酶的活性下降。并且通过高通量分析DNA甲基化确定了至少19个CpG位点与DN的发生密切相关，但在1型糖尿病患者中，糖尿病相关基因UNC13B则出现了DNA的高甲基化。这说明DNA的甲基化在DN中的作用机制以及作用模式比较复杂。在新近的一项临床试验中发现糖尿病患者血清白细胞介素17（interleukin－17，IL－17）、白细胞介素6（interleukin－6，IL－6）、超敏CRP（hypersensitive C－ractive protein，hsCRP）等炎症因子明显高于健康组（P＜0.05），且糖尿病肾病组显著高于单纯糖尿病组（P＜0.05）［21］。从表观遗传学领域探索机制，采用甲基化特异性PCR技术（Methyl－specific PCR，MSP）检测大鼠主动脉各炎症因子基因启动子区的甲基化水平，结果显示糖尿病组IL－17、IL－6、肿瘤坏死因子α（TNF－α）等基因启动子区的DNA甲基化水平显著低于正常组，并与mRNA和蛋白的表达水平成负相关。上述研究提示高糖诱导基因组DNA甲基化水平改变致炎性基因高表达可能是糖尿病肾病病变一个潜在原因［18］。

3.2 组蛋白修饰与糖尿病肾病 组蛋白修饰是表观遗传学中的另一项重要的内容。其在糖尿病肾病的发病过程中也扮演着重要的角色。目前对于糖尿病肾病的发病机制存在一个共识，即DN患者的肾脏血管发生了炎症改变。与单纯的糖尿病人相比，炎症因子均有不同程度的升高。NF－ΚB是DN炎症通路的重要因子之一。当机体处于高糖状态或者血糖控制不佳时，NF－ΚB的含量明显升高［17］。继而可以募集炎症细胞在肾脏血管壁聚集并活化下游的炎症因子，从而造成肾脏的血管炎性损伤，继而出现临床症状。Sayyed等［22］将暴露于高糖环境的牛主动脉内皮细胞的染色质免疫提纯，发现组蛋白甲基转移酶Set7富集于NF－KB p65基因的启动子区激活转录，当小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）使Set7沉默或敲除时，高糖无法诱导NF－KB p65基因的高表达［23］。Set7为特异性的单甲基化酶靶向作用于组蛋白赖氨酸4（H3K4）［24］，表明高糖致NF－KB表达增加可能是通过Set7催化H3K4ml实现的。

肾脏细胞外基质过度蓄积和肾小管上皮－间质转型将导致肾脏纤维化，而肾脏纤维化和DN发病密切相关。组蛋白去乙酰酶决定了组蛋白乙酰化状态，从而调节基因的表达。实验证明，组蛋白去乙酰酶－2的活性在糖尿病模型大鼠中明显增强。并且还发现，组蛋白去乙酰酶抑制剂能明显减少细胞外基质的mRNA和蛋白的表达，并能防止肾小管上皮细胞上皮－间质转型。同时在正常大鼠的肾小管上皮细胞中用RNA干扰的方法是组蛋白去乙酰酶－2基因沉默后纤维连接蛋白的mRNA的表达水平有所减少［25］。

4 结语

近年来，表观遗传学对糖尿病肾病的具体作用机制还有待于进一步研究，但是已日益受到中外学者的重视，而且有可能成为未来治疗策略的理论基础。从理论上讲表观遗传学不仅可以揭示糖尿病肾病的发病机制，而且表观遗传药物具有比传统药物更高的治疗潜力和较低的不良反应。现在各种表观遗传药物，如DNA甲基化抑制剂等正在不同程度的研究中。我们相信在征服糖尿病肾病的道路上，表观遗传学将成为最有利最可靠的工具之一。

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