MMP-9、VEGF在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

冯永怀，吴柳松，冯子芳，肖庆邦，陈 琦

(1.遵义医学院附属医院 血液内科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

恶性淋巴瘤是一组源于淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，具有广泛浸润组织器官的特点，彩色多普勒可观察到肿瘤组织有丰富的血流信号。弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma，NHL)最常见的类型，在西方国家约占成人NHL 的30%～40%，在我国其构成比更高。肿瘤的侵袭播散与细胞外基质的降解和肿瘤的血管生成有着密切相关。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 是一种促血管生成因子，是肿瘤微血管形成的最重要调节因子。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)家族成员众多，MMP-9是其中的重要成员，也是近年来的研究热点，它主要通过降解细胞外基质，对肿瘤的浸润和转移起重要作用。许多实验研究表明，VEGF不仅在许多实体瘤中表达上调，还与这些肿瘤的预后相关，因此常被作为一些肿瘤的治疗靶点。但对VEGF与DLBCL发病及侵袭转移的报道不多。我们应用Envision免疫组化法检测DLBCL及良性反应性增生淋巴结组织中VEGF及MMP-9的表达情况，以探讨MMP-9、VEGF与DLBCL发病、侵袭恶化之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 2009年1月至2013年1月在遵义医学院附属医院收治的经病理组织学确诊的DLBCL65例，诊断标准参照新版WHO 关于淋巴造血组织肿瘤分类(2008)[1]。临床分期按Ann Arbor-Colswolds分期标准：I期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期35例，Ⅳ期19例，发病部位结外23例，结内42例；按伴随症状分为A组16例，B组(伴发热、盗汗、消瘦等症状者)49例，所有患者术前未经放疗和化疗。20例淋巴结反应性增生作为对照组，其中包括13例男性，7例女性，年龄在16～72岁，中位年龄为51岁。

1.2 试剂 人MMP-9、VEGF多克隆抗体均购自广州华拓生物科技有限公司，浓度均为1∶100；试剂盒、DAB显色剂等均购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.3 方法 采用Envision免疫组织化学染色法。将3～4μm的石蜡切片，常规脱蜡至水，加3% H2O2处理，于枸橼酸缓冲液(pH6.0)中高压修复，滴加一抗放4℃冰箱冷藏过夜后，滴加生物素化二抗，DAB显色。苏木精复染，脱水透明、封片。选择试剂公司提供的MMP-9阳性、VEGF阳性的切片作为阳性对照，使用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 MMP-9 、VEGF的阳性信号均为淡黄色或棕黄色，主要定位于细胞质。随机选择5个高倍视野，合并计算所分析的不同视野的染色强度及染色细胞百分数，据显色深浅计分及阳性细胞百分率计算[2]：①显色深浅:不显色或显色不清为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；深褐色为3分。②阳性细胞的百分率：阳性细胞率0%～5% 计0分；5%>～10%计1分；10%>～50% 计2分；50%>～75%计3分；>75%计4分。显色深浅评分与阳性细胞百分率相乘，0～3分为阴性(-)，3～6分为弱阳性(+)，6～9分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0 软件进行统计学分析。计数资料采用2检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-9在肿瘤细胞及反应性增生淋巴结组织中的表达 MMP-9在DLBCL组织中的阳性表达率为78.46%(51/65) ；MMP-9在淋巴结反应性增生组织中的阳性表达率为15%( 3 /20)；两组比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表1，图1A，图1B)。

2.2 VEGF在肿瘤细胞及反应性增生淋巴结组织中的表达 VEGF在DLBCL组织中的阳性表达率为67.69%(44/65) ；VEGF在淋巴结反应性增生组织中的阳性表达率为5%(1 /20)；两组比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表1，图1C，图1D)。

2.3 MMP-9、VEGF在DLBCL中的表达与临床指标之间的关系 MMP-9、VEGF在DLBCLⅢ期、Ⅳ期的表达量高于Ⅰ期、Ⅱ期(P<0.05)；伴有发热、盗汗、消瘦等B症状的B组患者其VEGF的表达高于不伴以上症状的A组患者(P<0.05)，MMP-9的表达与是否伴有B症状无关(P>0.05)；MMP-9、 VEGF的表达均与DLBCL是否累及结外组织无差异性(P>0.05)(见表2)。

表1 MMP-9、VEGF在DLBCL肿瘤细胞及反应性增生淋巴结组织中的表达

组别例数MMP-9阳性阴性PVEGF阳性阴性DLBCL6551144421Lymphocytes20317119

DLBCL与Lymphocytes比较P<0.05。

A：MMP-9在DLBCL呈阳性表达(IHC ×200)；B：MMP-9在淋巴结反应性增生中呈阴性表达(IHC ×400)；C：VEGF在DLBCL呈阳性表达(IHC ×400)；D：VEGF在反应性淋巴结增生中呈阴性表达(IHC ×400)。图1 MMP-9、VEGF在DLBCL和淋巴结反应性增生中表达

表2 DLBCL中MMP-9、VEGF的表达及与临床指标之间的关系

临床指标例数MMP-9阳性阴性PPVEGF阳性阴性P临床分期Ⅰ&Ⅱ期1165<0.0547<0.05 Ⅲ&Ⅳ期544594014分组A16124>0.05610<0.05B4939103811结外组织累及情况结内423210>0.052913>0.05结外23194158

2.4 DLBCL中MMP-9的表达与VEGF表达的差异性比较采用配对2检验分析DLBCL中MMP-9和VEGF之间表达的差异性，可知VEGF表达和MMP-9的表达无差异性(2= 0.94，P>0.05) (见表3)。

表3 DLBCL中MMP-9的表达与VEGF表达的差异性

VEGFMMP-9+-+3311-183

VEGF、MMP-9比较P>0.05。

3 讨论

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常见的一种，在欧美国家的发病率约占NHL的30%，在亚洲国家发病率则更高，约占B细胞淋巴瘤的50%左右。DLBCL具有恶性程度高，侵袭性强，治愈率低的特点，严重危害人类健康。

MMP家族成员与肿瘤的进展关系一直以来备受关注。研究发现，很多MMP-9家族成员与肿瘤的发生及侵袭转移有关。MMP-9是目前研究较多的一类基质金属蛋白酶，它与肿瘤发生、发展、侵袭和转移关系最为密切。对人体多种肿瘤进行研究，结果表明在不同实体瘤中MMP-9有不同程度的增高，并与肿瘤进展及预后相关。MMP-9与淋巴瘤之间关系的研究主要集中在NHL，认为MMP-9、MMP-2及MMP-26在NHL中高表达，并与Ann Arbor临床分期相关，与恶性淋巴瘤的高侵袭性密切相关[2,11]，而对于占NHL中较大比例的DLBCL而言，研究尚少。赵文辉等[9]的研究表明MMP-9与NHL生存期呈负相关，是其预后差的指标。本研究结果表明，DLBCL中MMP-9的表达高于正常淋巴组织，且与DLBCL的临床分期有关，进一步证实MMP-9与DLBCL的发病、侵袭进展乃至预后都可能有着较为密切的关系。

肿瘤的侵袭播散与细胞外基质的降解和肿瘤的血管生成密切相关。VEGF是具有高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，被认为是最强的促血管生成因子，研究表明其在许多肿瘤组织中高表达，能促进肿瘤细胞血管生成，在肺癌、胆管癌、肠癌等诸多肿瘤中均有表达[3-5]。近年来，许多实验研究表明，淋巴瘤中存在VEGF的广泛表达[6-7]，并与淋巴瘤预后有关。张贵鹏等[8]通过检测血浆中的VEGF，发现初治DLBCL患者血浆中的VEGF显著高于正常对照组，VEGF的高表达不仅与疗效存在相关性，还可能参与了DLBCL细胞耐药。赵文辉[9]等检测了VEGF在非何杰金淋巴瘤的表达，发现67.69%的标本中有VEGF的阳性表达，不同的病理类型中VEGF的表达亦不同，提示VEGF的表达可能与淋巴瘤恶性程度有关。我们应用免疫组化方法检测了VEGF在DLBCL组织中呈高表达，结果显示DLBCLⅢ期、Ⅳ期的表达量高于Ⅰ期、Ⅱ期，且具有B症状DLBCL患者VEGF的表达增高。提示VEGF的表达可能与淋巴瘤的侵袭性有关，这与赵文辉[9]、朱江等[10]的研究结果相符。VEGF在DLBCL中的高表达可能赋予肿瘤细胞强的增殖能力及侵袭能力，检测VEGF对判断DLBCL的生物学行为有帮助。

综上，MMP-9、VEGF在DLBCL均呈高表达，它们的表达均与DLBCL临床分期有关，在Ⅲ、Ⅳ期患者阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者；VEGF在阳性率表达率还与伴发症状有关，因而认为MMP-9、VEGF均参与了DLBCL的发生、发展，可能与淋巴组织恶变有关。

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