人ERGIC3基因稳定表达支气管上皮细胞株的建立与迁移能力

郑 翔，刘兴宇，李学英，吴明松

(遵义医学院 细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563099)

ERGIC3主要参与蛋白质从内质网到高尔基体的早期运输，近年的研究显示，ERGIC3在肺癌、肝癌中异常高表达，还参与肺癌[1]、肝癌[2]的发生发展，以及抑制Brefeldin (BFA)诱导的HEK-293细胞凋亡[3]，然而机制尚不清楚。大多数肺癌起源于支气管上皮细胞[4]，因此我们构建了pLXSN-ERGIC3真核表达载体，并将其转染入支气管上皮细胞BEAS-2B，筛选出稳定转染ERGIC3的支气管上皮细胞株，为进一步研究ERGIC3基因在肺癌中的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 BEAS-2B细胞、PT-67细胞由中科院昆明动物所曹毅研究员惠赠。定量PCR仪机型为Bio-rad公司产品(型号：iCycler iQ)。pLXSN载体购自美国Clontech公司，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，SYB Green购自Invitrogen公司，感受态大肠杆菌DH5α和逆转录酶M-MLV购自Promega公司，Taq酶和ERGIC3多克隆抗体购自Sigma公司，β-actin一抗和HRP标记二抗购自美国Proteintech公司，ECL试剂购自美国Millipore公司。人肺组织为肺癌患者手术后20 min内取材，立即放入液氮中保存备用。

1.2 细胞培养 BEAS-2B细胞和PT-67细胞生长于含10%胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。2～3 d换液，3～5 d传代，细胞处于对数生长期时用于实验。

1.3 引物设计及合成 参照GenBank的人ERGIC3基因序列(NM_198398.1)，用Primer 5.0软件设计PCR引物，P1：5'-GGTGGTGAATTCATGAGGCGCT GGGGAAGCT-3'，P2：5'-GGTGGTGGATCCACCGAGGAGGGTGACTACGTTGT CTT-3'，在引物的5'端分别加上保护碱基GGTGGT和EcoR I、BamH I的酶切序列。定量PCR引物：ERGIC3: F: 5'-GGAGAGGTACTGAGGACAAATCA-3'，R: 5'-AGCTCATAGAGGACGAAGACTC-3'； β-actin: F: 5'-CGGGAAATCGTG CGTGAC-3'，R: 5'-CAGGA AGGAAGGCTGGAAG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人ERGIC3基因的扩增 用TRIzol试剂提取人肺组织总RNA，以其为模板，随机引物为引物，用逆转录酶M-MLV合成cDNA。再以此cDNA为模板，P1、P2为引物，经 PCR扩增得到ERGIC3基因的ORF框DNA片段。反应体系：cDNA模板 5 μL，10×缓冲液10 μL，dNTP(10 mM)2 μL，引物P1、P2(10 μM)各2 μL，高保真Taq 酶2 μL，灭菌水补足体积至100 μL。PCR反应程序：94℃ 5 min，然后94℃30 s，58℃ 1min，72℃ 2.5 min，共30个反应循环。定量PCR以 β-actin 为内参，采用2△△CT方法[5]，以3次实验的平均△CT值计算基因的相对表达量。

1.5 重组真核表达质粒的构建 RT-PCR产物和pLXSN质粒分别经EcoR I和BamH I双酶切，37℃酶切2 h后，琼脂糖电泳回收目的基因片段和载体片段，稀释浓度至50 ng/μL。再用T4 DNA连接酶连接，电转化感受态大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB培养基平板中37℃培养过夜，挑取阳性克隆，抽提质粒后进行PCR及双酶切鉴定，将初步鉴定正确的菌液送华大生物有限公司测序。构建正确的重组表达质粒命名为pLXSN-ERGIC3，以pLXSN的空载体为对照组。

1.6 pLXSN-ERGIC3逆转录病毒的包装 PT-67细胞接种于25 mL培养瓶中，第2天细胞汇合度在60%～80%，用脂质体Lipofectamine LTX转染pLXSN-ERGIC3质粒，48 h后收集病毒上清。室温低速离心5 min，去除细胞碎片，收集病毒液，用0.45 μm的醋酸纤维膜过滤病毒液，-80℃保存备用。

1.7 稳定转染细胞系的建立

1.7.1 pLXSN-ERGIC3病毒颗粒感染BEAS-2B细胞 BEAS-2B细胞接种于6孔板中，次日细胞汇合度在40%～60%，换为含有pLXSN-ERGIC3病毒颗粒的培养液，加入终浓度为6 μg/mL的 Polybrene，24 h后换为正常培养液。

1.7.2 稳定转染细胞株的筛选与建立 病毒颗粒感染后48 h，将细胞1∶5传代，同时培养液中加入G418 (终浓度为400 μg/mL)，每3～5天更换含G418的培养液，待长出克隆后将其挑出，进行单克隆化培养。

将上述的克隆挑取几个，用有限稀释法稀释细胞悬液，并接种于96孔板中。于第2天和第3天观察，标记只有1个细胞的孔。每3～5 天更换含G418的培养液，待长出克隆后将其消化逐级扩大培养：96孔板、48孔板、24孔板、6孔板。之后进行q-RT-PCR和Western blot鉴定。

1.8 稳定转染细胞株的鉴定

1.8.1 q-RT-PCR检测 收集稳定转染细胞，提取总RNA、逆转录以及定量PCR等操作见1.4。

1.8.2 Western blot检测 收集稳定转染细胞，用适量细胞裂解液裂解并提取蛋白，BCA法定量蛋白浓度，煮沸变性后，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭，4 ℃冰箱孵育一抗(ERGIC3 1∶500，β-actin 1∶10000)过夜，TBST洗涤，然后室温孵育HPR标记的二抗(1∶2000) 1 h，用ECL化学发光法进行曝光、显影。以β-actin作为内参，实验重复3次。

1.9 稳定转染细胞株的划痕试验 6孔板中加入5×105个细胞，过夜能铺满培养板底。第2天用10μL枪头划3条线。用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。按0、24 h，每孔取相交处拍照。计算细胞迁移率。公式为：

2 结果

2.1 ERGIC3基因扩增及表达载体构建 用RT-PCR扩增得到ERGIC3基因的ORF DNA片段(见图1.A，条带1)为1200 bp，与预期结果一致。扩增产物经EcoR I和BamH I双酶切、纯化后(见图1B，条带1)插入到线性化的pLXSN质粒中(见图1B，条带2)，再转化至感受态大肠杆菌DH5α，并扩大培养后抽提质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行酶切鉴定，1.5%琼脂糖电泳结果显示，在约1200 bp处的条带为ERGIC3的ORF DNA条带 (见图1C，条带1)，初步确定载体构建成功。该质粒的测序结果显示，DNA序列正确(数据未显示，pLXSN-ERGIC3载体构建成功。ERGIC3有2种剪切方式，mRNA分别对应变异体1 (variant 1)和变异体2 (variant 2)。通过序列比对，获得的序列为ERGIC3变异体2。)

M：DNA marker。图1 重组pLXSN-ERGIC3质粒的构建与鉴定

2.2 稳定过表达ERGIC3细胞株建立 BEAS-2B感染了ERGIC3的逆转录病毒后，通过G418筛选、单克隆化后，得到4株稳定过表达ERGIC3的BEAS-2B细胞株。其mRNA的表达水平，分别是稳定转染pLXSN空载体的BEAS-2B的45.3、48.8、41.5和28.2倍(见图2B)。进一步的Western blot 结果也显示，稳定表达ERGIC3的BEAS-2B细胞株的ERGIC3蛋白水平明显高于对照组(见图2A)。

pLXSN：空载体；pLXSN-ERGIC3(1)～(4)分别代表稳定过表达ERGIC3的BEAS-2B细胞株。 图2 稳定转染ERGIC3细胞株中ERGIC3 mRNA和蛋白表达量

2.3 稳定过表达ERGIC3细胞株迁移速度及形态变化 我们选择了表达量最高的稳定转染细胞株进行功能试验，划痕实验结果表明，稳定过表达ERGIC3细胞株的细胞迁移速度明显增加(P<0.05)(见图3)，但细胞呈梭形、多角形等形状，与对照组细胞相比，形态没有明显变化(见图4)。

图3 稳定转染ERGIC3细胞株的迁移能力(*P<0.05)

图4 稳定过表达ERGIC3细胞株的形态

3 讨论

人ERGIC3 (endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3)属于II型跨膜蛋白，也是内质网-高尔基体间的循环蛋白[6-7]，由383个氨基酸残基组成，分子量为43.2 kDa。本研究发现，支气管上皮细胞BEAS-2B稳定过表达后，细胞有一定的恶变倾向，表现为其迁移能力增加，而癌细胞迁移能力是癌细胞扩散转移的前提条件，因此，ERGIC3稳定过表支气管上皮细胞株可以作为肺癌转移的较好的细胞模型。

建立稳定转染的方法很多，其关键是基因插入细胞的基因组中。其方法主要有脂质体介导法，病毒感染法等，后者又分为逆转录病毒和慢病毒2种方式。脂质体介导法的最大不足在于脂质体转染后目标基因在基因组整合概率低，而慢病毒需要多种包装质粒共同转染，逆转录病毒能感染难转染细胞并且效率高、易于插入到基因组转录活性较高的部位。因此，本研究采用逆转录感染细胞的方法。选择支气管上皮细胞，原因之一是肺癌大多起源于支气管上皮细胞[4, 8]，原因之二是正常支气管上皮细胞中ERGIC3的表达水平很低，而87%肺癌患者的ERGIC3表达水平上调[1]。本研究结果表明，ERGIC3在支气管上皮细胞过表达后，细胞的迁移能力明显增加，提示ERGIC3在肺癌的转移过程中具有重要作用，而肿瘤转移一直是肿瘤的最核心的问题[9-10]，大多数癌症患者死于癌细胞转移。ERGIC3可能不是通过EMT的机制促进癌细胞的迁移能力的，因ERGIC3转染入BEAS-2B细胞后，其形态学没有明显变化，未形成典型的间充质样细胞形态。至于ERGIC3在体内是否参与了肺癌细胞的MET过程，还需进一步研究。ERGIC3促进细胞迁移的机制可能是：①ERGIC3通常和另一个与之高度同源的蛋白Erv41结合形成异二聚体而发挥生物学功能[11-12]，参与加强内质网中新合成的参与细胞运动的蛋白质的运输，增加细胞的运动能力；②mi490p以ERGIC3为靶点促进肺癌的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，但是，其具体的机制尚不清楚。对ERGIC3的生物学功能研究，近年才刚刚开始，随着对ERGIC3的认识的深入，也许会有重要的发现。

综上所述，本研究获得的人ERGIC3基因稳定表达支气管上皮细胞株可以作为肺癌转移的较好的细胞模型，为研究ERGIC3在肺癌中的病理生理功能提供了实验基础，同时也为研究ERGIC3的细胞生物学功能提供了基础。

致谢：本工作得到曹毅先生的指导，特此感谢。

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