白叶蒿提取物抗菌活性及抗菌增效作用

李维宏，彭 伟，任传亮，李 斌

(1.重庆医科大学第一附属医院 生殖健康与不孕症专科， 重庆 400016；2.第三军医大学 药学系 药理学教研室，重庆 400038)

白叶蒿 Artemisia leucophylla (Turcz. Ex Bess.) Clarke 为菊科蒿属多年生草本植物，主要生长于我国四川，新疆，西藏，甘肃，宁夏等海拔3000～4000米的地区，其全草部分具有驱寒、止血、消炎等作用[1-2]，白叶蒿挥发油具有镇咳、祛痰和抗真菌作用[3]，但目前对于白叶蒿的抗细菌活性和是否具有抗菌增敏活性未见研究报道。本研究对白叶蒿全草的乙醇提取物及其极性部位进行了抗菌和抗菌增敏活性评价，将为白叶蒿资源的深入开发利用，从中寻找新的具有抗菌活性的物质或抗菌增敏剂奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 实验用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、肠球菌临床分离株均由第三军医大学附属第一医院检验科提供。为保证细菌实验结果的稳定性和可靠性，实验中采用国际标准菌株大肠埃希菌ATCC35218和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控对照菌株。

1.1.2 药物 注射用氨苄西林钠(华北制药股份有限公司)、舒氨西林 (注射用氨苄西林钠舒巴坦钠，深圳市海滨制药有限公司)、注射用苯唑西林钠(西南药业股份有限公司)、注射用头孢呋辛钠(深圳致君制药股份有限公司)均4°C保存，使用前用无菌LB培养液稀释成所需母液浓度。白叶蒿药材采自四川茂县，经第三军医大学生药学教研室鉴定为菊科白叶蒿A. leucophylla (Turcz. Ex Bess.) Clarke全草。各分离部分采用DMSO溶解，使用前用无菌LB培养液稀释成所需母液浓度。

1.2 方法

1.2.1 药物提取与分离 白叶蒿全草药材自然干燥后粉碎，200目筛过滤后，8倍量体积70%乙醇回流提取3次，每次2 h，减压干燥后得到总提取物。总提取物以水混悬，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取并回收，依次得到白叶蒿石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水部分。

1.2.2 白叶蒿提取物各部分最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)的测定 采用二倍微孔稀释法[4]。 调整细菌浓度为105CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，所有待测药物均以无菌LB培养液稀释至所需浓度，抗生素溶液均为无色透明液体，白叶蒿提取物溶解后呈淡黄色透明溶液。将4种β-内酰胺类抗生素分别氨苄西林、苯唑西林、舒氨西林、头胞呋辛钠及白叶蒿提取物各部分分别加入至含细菌培养孔内，使最高终浓度达到4096 μg/mL，然后依次倍比稀释，使每孔中药物的最终浓度依次2倍减小(4096、2048、1024～1μg/mL)。同时设立阳性对照(菌液)、阴性对照(无菌LB培养液)。每组3孔，每孔100 μL，置37 ℃培养箱孵育24 h后，根据24 h后培养孔内的液体清亮程度判断每种药物的MIC值，MIC值为观察到培养孔内液体清亮时的最低药物浓度。质控根据阴性对照和阳性对照进行判断，阴性对照孔应为清亮，如阴性对照孔浑浊表面实验过程发生污染；阳性对照孔应为混浊，如阳性对照孔清亮则表明细菌培养中细菌活力出现问题。

1.2.3 白叶蒿正丁醇部分与抗菌药物联合应用时对不同细菌MIC的影响 采用棋盘式微孔稀释法[5]，调整细菌浓度为105CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，加入不同的抗生素(氨苄西林：简称“AMP”； 苯唑西林：简称“OXA”；舒氨西林：简称“SAM”；头孢呋辛钠：简称“CEF”)，依次倍比稀释，使其终浓度自2048 μg/mL至2 μg/mL。再依次加入相应浓度的白叶蒿正丁醇部分(BUE)，使培养体系中的BUE浓度范围为1024 μg/mL至32 μg/mL；置37℃培养箱孵育24 h，记录BUE和抗生素联合使用时药物对细菌的MIC，并计算部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration index, FICI)。FICI计算公式如下。判断标准：FICI ≤0.5，协同作用；0.5～ 4.0，无关作用；> 4.0，拮抗作用[6]。

1.2.4 白叶蒿正丁醇部分与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌生长的影响 参照文献方法[7]，调整细菌浓度为106CFU/mL，测定菌液OD600值为0.002 (1 OD=5×108CFU/mL)，参照单独MIC实验结果，分别单独加入终浓度为16 μg/mL或 的32 μg/mL BUE(1/4 MIC)或低于MIC浓度的抗菌药物，以及同时加BUE和抗菌药物后，置于37°C恒温摇床150 rpm振摇24 h，分别测定1、3、5、7、9、12、18、24 h时菌液的OD600值，并绘制时间-细菌浓度曲线。

1.2.5 结果判断 药物对细菌的MIC为24h后抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度；统计BUE单独及与抗菌药物联合使用时不同时相点时细菌计数情况。

2 结果

2.1 白叶蒿提取物和不同抗菌药物单独使用时对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、肠球菌临床分离株的MIC 实验结果显示，白叶蒿总提物及各极性回收部分对5种临床分离株细菌均显示出一定的抗菌活性，其中乙酸乙酯和正丁醇部分显示出较强的抗菌活性，正丁醇部分对大肠埃希菌的MIC为64 μg/mL，对肺炎杆菌的MIC为64 μg/mL，对金黄色葡萄球菌和肠球菌的MIC为128 μg/mL；乙酸乙酯部位对大肠埃希菌和肺炎杆菌的MIC为128 μg/mL，对金黄色葡萄球菌和肠球菌的MIC为256 μg/mL，正丁醇部分和乙酸乙酯部分对绿脓杆菌的MIC分别为256 μg/mL和512 μg/mL。

虽然上述白叶蒿提取物对5种细菌的MIC值均大于64 μg/mL，未呈现出非常强的抗菌活性，但5种β内酰胺类抗生素对上述5种细菌的MIC也大于16 μg/mL，根据2013美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的判定标准，肠杆菌科对头孢呋辛的MIC≥4，葡萄球菌属对苯唑西林的MIC≥4，肠球菌属及绿脓杆菌对氨苄西林的MIC≥8均判断为耐药，上述临床分离株细菌均为耐β内酰胺类抗生素的耐药菌株 (见表1)。

表1白叶蒿提取物和抗生素对5种细菌的MIC值(μg/mL)

MIC金黄色葡萄球菌大肠埃希菌肺炎杆菌肠球菌绿脓杆菌总提物102425651210242048石油醚部位5122562565121024乙酸乙酯部位256128128256512正丁醇部位1286464128256水部位51212851210242048氨苄西林5125122565121024苯唑西林512256256512256舒氨西林163264128512头胞呋辛钠16163264128

2.2 白叶蒿正丁醇部分(BUE)与不同抗菌药物联合使用后对5种细菌的MIC值的影响 结果显示，采用1/4 MIC的白叶蒿正丁醇部分(BUE)与不同β内酰胺类抗生素联合使用时对几种临床分离株细菌均呈现出一定的抗菌增敏作用，可使细菌对几种β内酰胺类抗生素的MIC降低4～16倍，其中BUE与舒氨西林或头孢呋辛钠联合使用时对金黄色葡萄球菌的协同作用最强，32 μg/mL BUE(1/4 MIC)即可使舒氨西林、头孢呋辛钠的MIC降低至原先的1/16 (1 μg/mL)，其FICI为0.3125；16 μg/mL BUE(1/4 MIC)可使头孢呋辛钠对大肠埃希菌的MIC降低至单独使用时的1/16 (1 μg/mL)，其FICI为0.3125；还可使其他几种细菌对抗生素的MIC明显降低，FIC均≤0.5，表明BUE与β内酰胺类抗生素联合使用时均可呈现出一定的抗菌增敏作用 (见表 2)。

表2白叶蒿提取物正丁醇部分与抗菌药物联合使用后对5种细菌MIC的影响

细菌种类氨苄西林+BUE苯唑西林+BUE舒氨西林+BUE头胞呋辛钠+BUE金黄色葡萄球菌MIC1/8 MIC+32 μg/mLBUE1/8 MIC+32 μg/mLBUE1/16 MIC+32 μg/mLBUE1/16 MIC+32 μg/mLBUEFICI0.3750.3750.31250.3125大肠埃希菌MIC1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/8 MIC+16 μg/mLBUE1/8 MIC+16 μg/mLBUE1/16 MIC+16 μg/mLBUEFICI0.50.3750.3750.3125肺炎杆菌MIC1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUEFICI0.50.50.50.5肠球菌MIC1/4 MIC+32 μg/mLBUE1/2 MIC+32 μg/mLBUE1/4 MIC+32 μg/mLBUE1/8 MIC+32 μg/mLBUEFICI0. 50.750.50.375绿脓杆菌MIC1/2 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUEFICI0.750.50.50.5

2.3 白叶蒿正丁醇部分与抗菌药物联合应用对细菌生长的动态影响 结果显示，在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、肠球菌、绿脓杆菌5株细菌培养体系中加入低于MIC浓度的白叶蒿正丁醇部分(BUE)或/和抗菌药物，对照组(Broth组)细菌均生长迅速；单纯BUE组生长速度均较Broth组减慢，24 h时细菌数量较Broth组一定程度降低；低于MIC浓度的单纯抗菌药物处理组细菌生长速度同样较Broth组减慢，但24 h才能基本达到Broth组水平；而BUE与抗菌药物联合使用后5株细菌生长受到明显抑制，细菌生长速度较单纯抗菌药物处理组均明显减慢，提示BUE和抗菌药物联合使用后能明显增强抗菌药物对细菌生长的抑制作用(见图1～5)。

**P<0.01，与单独CEF组比较；## P<0.01，与单独SAM组比较；△△P<0.01，与单独AMP组比较；※※P<0.01，与单独OXA组比较；n=3。图1 BUE协同抗菌药物对金黄色葡萄球菌生长的动态影响

**P<0.01，与单独CEF组比较；## P<0.01，与单独SAM组比较；△△P<0.01，与单独AMP组比较；※※ P<0.01，与单独OXA组比较；n=3。图2 BUE协同抗菌药物对大肠埃希菌生长的动态影响

** P<0.01，与单独CEF组比较；## P<0.01，与单独SAM组比较；△△P<0.01，与单独AMP组比较；※※ P<0.01，与单独OXA组比较；n=3。图3 BUE协同抗菌药物对肺炎杆菌生长的动态影响

**P<0.01，与单独CEF组比较；## P<0.01，与单独SAM组比较；△△ P<0.01，与单独AMP组比较；※※P<0.01，与单独OXA组比较；n=3。图4 BUE协同抗菌药物对肠球菌生长的动态影响

**P<0.01，与单独CEF组比较；## P<0.01，与单独SAM组比较；△△P<0.01，与单独AMP组比较；※※ P<0.01，与单独OXA组比较；n=3。图5 BUE协同抗菌药物对绿脓杆菌生长的动态影响

3 讨论

白叶蒿别名白毛蒿(东北植物检索表)，苦蒿(四川)，野艾蒿(河北)，茭蒿(内蒙古)，朝鲜艾(吉林)，白蒿(俗称)，为多年生草本植物，可作“家艾”的代用品全草药用，有温气血、逐寒湿、止血、消炎的作用[1-2]。目前关于白叶蒿化学成分及药理学作用鲜有文献报道，仅有研究发现白叶蒿脂肪酸成分具有降血脂功能[8]；白叶蒿挥发油可能具有镇咳、祛痰和抗真菌作用[3]，目前尚无其抗菌和抗菌增敏作用的研究。

我们通过对采自四川茂县的白叶蒿全草进行了分离纯化，已从白叶蒿中分离得到11个化合物，所有化合物均为首次从该植物中分离得到[9]。由于分离得到的化合物成分含量较少，无法进行单体化合物系统的活性评价，但对白叶蒿总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位进行体外抗菌评价实验后显示，总提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、肠球菌、绿脓杆菌5种临床分离株的细菌均显示一定的抗菌活性，其中以正丁醇部分的抗菌作用最强，但对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等5种临床分离株细菌的MIC值均≥64 μg/mL，鉴于上述临床分离株细菌均为耐β内酰胺类抗生素的耐药菌株，因此该抗菌作用活性强度仍具有一定的开发研究价值。更有意义的是，我们将低于MIC浓度的白叶蒿正丁醇部分与5种β内酰胺类抗生素联合使用，棋盘法MIC实验结果显示该正丁醇部分可明显降低几种β内酰胺类抗生素对5种细菌的MIC值，其中正丁醇部分与舒氨西林或头孢呋辛钠联合使用时对金黄色葡萄球菌的FICI为0.3125；正丁醇部分与头孢呋辛钠联合使用时对大肠埃希菌的FICI也为0.3125；正丁醇部分与其他几种β内酰胺类抗生素联合使用时对肝炎杆菌、肠球菌、绿脓杆菌的FICI也均≤0.5。结合部分抑菌浓度指数判断标准：FICI ≤0.5，协同作用；0.5 ～ 4.0，无关作用；> 4.0，拮抗作用[6]，上述结果表明白叶蒿正丁醇部分与β内酰胺类抗生素联合使用时可呈现出一定的抗菌增敏作用。由于药物对细菌的MIC实验是通过肉眼观察细菌培养孔内清亮程度来判断结果，且只能观察到24 h时细菌生长的受抑制情况，不能观察到准确的细菌数量的动态变化，而我们在实验中发现，正丁醇部分与抗菌药物联合使用后细菌培养孔内菌液浓度较未联合组明显减少。因此，我们进一步采用动态生长曲线法观察了正丁醇部分与几种抗菌药物联合使用后不同时间点时细菌生长的动态情况。结果证实，白叶蒿正丁醇部分单独使用时即可一定程度减慢细菌的生长速度，与抗菌药物联合使用后可以明显提高抗菌药物的抗菌效力，该结果同棋盘式稀释法结果一致。综合上述结果，我们认为白叶蒿不仅具有一定抗菌作用，还可对β内酰胺类抗生素产生抗菌增效作用，尤其是正丁醇部分有作为一种新型的抗菌增敏剂进一步开发利用的潜能。

[参考文献]

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[8] 张燕，张洪斌.白叶蒿脂肪酸成分研究[J].琼州学院学报，2008，15(5)：54-56, 59.

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