热休克蛋白70与重症急性胰腺炎严重程度的关系

杨 娜，李学晋，梁增坤，王兴鹏

(1. 河南省中牟县中医院，河南 中牟 451450；2. 新乡医学院三全学院，河南 新乡 453600；3. 上海市第一人民医院，上海 200092)

热休克蛋白70与重症急性胰腺炎严重程度的关系

杨 娜1，李学晋2，梁增坤1，王兴鹏3

(1. 河南省中牟县中医院，河南 中牟 451450；2. 新乡医学院三全学院，河南 新乡 453600；3. 上海市第一人民医院，上海 200092)

目的 探讨热休克蛋白70(HSP70)与重症急性胰腺炎严重程度之间的关系。方法 在重症急性胰腺炎大鼠模型复制成功后1 h、5 h、10 h，分别收集胰腺组织和血清；采用RealTime-PCR方法分别测定胰腺组织中HSP70 mRNA的表达情况，采用碘-淀粉比色法测定血清中淀粉酶水平，采用ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果 在模型复制成功后1 h、5 h、10 h，胰腺组织HSP70 mRNA的表达呈明显下降趋势，大鼠血清中淀粉酶和TNF-α呈明显升高的趋势。结论 在重症急性胰腺炎的发生过程中，胰腺组织HSP70表达逐渐下降，而胰腺组织的损伤程度逐渐加重，HSP70的低表达可能促使胰腺炎病情更加严重。

重症急性胰腺炎；热休克蛋白70；大鼠

重症急性胰腺炎(SAP)是临床上常见的急腹症、危重症，病死率居高不下，其发病机制非常复杂，众多学者提出了一系列学说，其中“急性胰腺炎自身消化学说”是一个经典学说，目前认为这一学说在SAP的发病过程中处于始动环节的地位[1-2]，但是胰腺腺泡细胞内酶原异常激活的机制还存在很大争议。目前研究发现，热休克蛋白70(HSP70)与SAP的关系非常密切，HSP70可能参与了胰腺腺泡细胞内酶原的异常激活[3-5]。为进一步探讨HSP70在SAP发病中的作用，笔者采用SAP大鼠模型进行了相关研究，现报道如下。

1 实验资料

1.1 SAP模型复制 选取体质量为200～250 g的SD大鼠40只，雌雄各半，购自复旦大学动物中心。随机将大鼠分为假手术组(Sham组，n=20)和SAP模型组(SAP组，n=20)。SAP大鼠模型的复制参照文献[6]的方法，即受试动物于术前禁食不禁水12 h，1.5%的戊巴比妥钠0.2 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉，无菌条件下行上腹正中切口，用动脉夹在近肝门处夹闭胆总管，经胰管十二指肠开口处从胰胆管逆向加压推注3%去氧胆酸钠(0.1 mL/100 g体质量，速度0.2 mL/min)，注射后压迫进针点1 min，解除胆管阻断，分层关腹。Sham组不注射去氧胆酸钠，其余操作同SAP组。造模后1 h、5 h、10 h，同上麻醉并取大鼠血液，离心取上清，并取胰腺组织置于液氮中留用。

1.2 胰腺组织HSP70 mRNA表达量检测方法 参照Li等[6]的方法抽提胰腺组织中的mRNA，分光光度计检测其260/280吸光度比值，计算RNA浓度；通过RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，观察18 s与28 s rRNA条带。65 ℃ 5 min,变性RNA，立即放入冰浴，用PCR仪(ABI公司提供)进行扩增，逆转录反应条件：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，反应物进行PCR。PCR反应条件：95 ℃ 预变性10 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s 40个循环扩增。HSP70的相对表达量以特异性基因HSP70的copy数与内参磷酸甘油酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的copy数的比值计算。HSP70及GAPDH引物序列用Primer510软件设计，由大连宝生物公司合成。HSP70引物序列：上游为5'-GGCTATCGCTACTGGT-3'，下游为5'-GCAAGTCGCTCGTTCA-3'(目的片段237 bp)；GAPDH引物序列：上游为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游为5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(目的片段452 bp)。

1.3 血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的检测 参照定量ELISA试剂盒(Sigma)说明书测定。

1.4 血清中淀粉酶的检测 参照淀粉酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定。

2 结 果

2.1 2组大鼠胰腺组织中HSP70 mRNA表达情况比较 Sham组和SAP组胰腺组织中的mRNA的5S、18S、28S亚基完整，见图1；Sham组和SAP组胰腺组织中mRNA的荧光定量PCR曲线，见图2；复制SAP模型后1 h，胰腺组织HSP70 mRNA的相对表达量最高，在随后的5 h、10 h时间点上，胰腺组织HSP70 mRNA的相对表达量呈现出明显下降趋势；在1 h时，SAP组与Sham组相比，HSP70 mRNA的相对表达量明显升高(P<0.05)；5 h时，SAP组与Sham组相比，HSP70 mRNA的相对表达量无显著性差异(P>0.05)；10 h时，SAP组与Sham组相比，HSP70 mRNA的相对表达量明显下降(P<0.05)。见表1。

图1 胰腺组织RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

2.2 2组大鼠血清中淀粉酶水平比较 复制SAP模型后1h、5h、10h时间点上，大鼠血清中淀粉酶呈现出明显升高的趋势；在1 h时，SAP组与Sham组相比，血清中淀粉酶的含量无显著性差异(P>0.05)；5 h、10 h时，SAP组与Sham组相比，血清中淀粉酶的含量明显升高(P<0.05)。见表2。

图2 荧光定量PCR仪的扩增曲线

组别1h5h10hSham组7.825±0.5768.326±0.7317.457±0.829SAP组15.476±1.327①②9.832±0.972②3.521±0.673①

注：①与Sham组比较，P<0.05；②与10 h SAP组比较，P<0.05。

表2 2组大鼠血清中淀粉酶水平比较

注：①与Sham组比较，P<0.05；②与1 h SAP组比较，P<0.05。

2.3 2组大鼠血清中TNF-α水平比较 复制SAP模型后1 h、5 h、10 h，大鼠血清中TNF-α呈现出明显升高的趋势；在1 h时，SAP组与Sham组相比，血清中TNF-α水平无显著性差异(P>0.05)；5 h、10 h时，SAP组与Sham组相比，血清中TNF-α的水平明显升高(P均<0.05)。见表3。

表3 2组大鼠血清中TNF-α水平比较

注：①与Sham组比较，P<0.05；②与1 h SAP组比较，P<0.05。

3 讨 论

近年来，众多学者认为胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原等的过早激活是SAP的早期事件，在SAP的发病过程中起到了扳机的关键作用，各种病因触发胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原、脂肪酶原等的激活，导致腺泡细胞的损伤和整个胰腺组织的破坏，进而累及机体多系统、多器官[7-9]。然而对胰酶胞内激活的机制，迄今并不十分清楚。

HSP70是HSP家族中的一员，是一种与细胞应激损伤关系密切的蛋白质，广泛存在于原核及真核细胞中，具有高度保守的序列。研究发现，如同其他的热休克蛋白一样，它在正常细胞中表达很低,但是在高温、缺氧、寒冷、感染、饥饿、创伤、中毒等因素刺激下表达增强,对提高细胞耐受应激的能力、维持细胞内环境的稳定具有重要的作用,认为是细胞的一种自身保护机制[10-12]。Lee等[13]发现，冷水浸浴法(CWI)预刺激能特异性地诱导胰腺细胞HSP60的合成，诱导产生的HSP能完全抑制雨蛙肽诱导的大鼠胰腺炎，并呈剂量相关性，并认为HSP能阻止细胞溶酶体组织蛋白酶B向消化酶原颗粒丰富部位移位，从而阻止溶酶体蛋白水解酶-组织蛋白酶B与消化酶的共区域化，抑制胰腺细胞内胰蛋白酶原的激活，减轻雨蛙肽诱导的胰腺炎模型的胰腺病理改变。本实验结果表明，在复制SAP模型后1 h，胰腺组织中HSP70 mRNA的表达增高，是胰腺细胞应激反应的表现，具有重要的代偿意义；在复制SAP模型后5 h以及10 h，胰腺组织中HSP70 mRNA的表达量持续显著下降，并且胰腺组织损伤程度更为严重，表现为血清中的淀粉酶及TNF-α水平明显升高等。提示胰腺组织HSP70的表达下降可提高胰腺组织对损伤因子的敏感性，在胰腺腺泡中,低表达的HSP70可能参与酶原的过早激活进而使胰腺组织发生自身消化，进而导致炎症细胞聚集和炎症反应的发生，HSP70的低表达可能促使胰腺炎的病情更加严重。综上，本研究在整体水平上初步揭示HSP70与SAP之间的关系，对于HSP70如何参与胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原的过早激活尚需要进一步的研究阐明。

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Relationship between Heat shock protein 70 and the severity of severe acute pancreatitis

Yang Na1, Li Xuejin2, Liang Zengkun1, Wang Xingpeng3

(1. The Traditional Chinese Medical Hospital of Zhongmou County, Zhongmou 451450, Henan, China; 2. Sanquan College of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453600, Henan, China; 3. The First People's Hospital of Shanghai, Shanghai 200092, China)

Objective It is to explore the relationship of Heat shock protein 70 with the severity of severe acute pancreatitis. Methods Pancreatic tissues and serum were collected respectively in 1h, 5h, 10h after severe acute pancreatitis models were copied successfully. Realtime-PCR was used to detect the expression of HSP70 mRNA in pancreastic tissue. Iodin-amylum colorimetry was used to detect amylase level in the serum.ELISA was used to detect the level of TNF-α in the serum. Results In 1 h, 5 h, 10 h after severe acute pancreatitis models were copied successfully. the expression of pancreas HSP70 mRNA appeared downward trend (P<0.05), the amylase and TNF-α level in serum of rat appeared increased trend significantly (P<0.05). Conclusion In the process of the occurrence of severe acute pancreatitis, the expression of pancreas HSP70 gradually decreased, and the degree of injury was more severer, lower expression of HSP70 may increase the severity of acute pancreatitis.

severe acute pancreatitis； Heat shock protein 70; rat

杨娜，女，主治医师，研究方向为消化系统疾病。

王兴鹏，E-mail：xpwcn@public7.sta.net.cn

国家自然科学基金资助项目(30770978)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.13.002

R0657.51

A

1008-8849(2014)13-1372-03

2013-12-30