牦牛LEPR 基因第4 外显子PCR-SSCP 实验条件的优化

苟红晶

(甘肃省庆阳市畜牧技术推广中心，745000)

1 前言

瘦素受体基因（leptin receptor，LEPR）可直接或间接地影响下丘脑-垂体-性腺轴的功能，对黄体生成素释放激素、促卵泡素和黄体生成素的释放呈现双向调节。因此，近年来有关家畜LEPR基因多态性和基因突变的研究已成为热点之一。SSCP是目前分析单核苷酸多态性（SNPs）较为有效、简单的方法之一。

1989年Orita等提出了SSCP的概念,并将此法用于检测复杂基因组单拷贝DNA中的多态现象。1992年,Hoshino等对SSCP分析法又作了大胆改进,PCR-SSCP分析法从此确立。由于它具有检测灵敏性高，操作简单，技术容易掌握，实验成本低，适合于大量样品的筛选，对DNA原材料纯度要求不高，所需量少等优点，因此目前被广泛用于基因突变的检测，包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失[1]。 其缺点是许多因素都会影响SSCP的分析结果，基因的差异、片段的大小都会造成其分析条件的变化，难以有一个相对固定的分析条件，需要试验人员不断地探索。影响该技术成功的主要因素有PCR的特异性、凝胶浓度、聚丙烯酰胺的交联度、甘油、电泳温度及时间等[2-3]。此外，PCR产物与变性上样缓冲液的比例、上样量、电压、电泳缓冲液的离子浓度亦影响试验结果[4]。因此，本试验以牦牛LEPR基因第4外显子为研究对象，在前期对该片段PCR条件优化的基础上，就凝胶浓度、交联度、电泳时间等影响SSCP分析结果的因素进行优化，以期准确建立牦牛LEPR基因的PCR-SSCP条件，为进行牦牛LEPR基因多态性分析奠定良好的基础，同时为其他基因PCR-SSCP最优实验条件的建立提供参考。

2 材料与方法

2.1血样来源

于2013年9月在甘南州碌曲县李洽如牧场采集牦牛血样165份，每头牦牛颈静脉采取新鲜血液10 mL，按抗凝剂与血液体积比1：5加入ACD抗凝，保存于-70℃。

2.2主要试剂

蛋白酶K、Tris饱和酚、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED、Tris碱、EDTA，过硫酸铵为进口药品；PCR过程中所需的DNA Taq酶，dNTP购自大连宝生物公司；乙酸、乙醇、甲醛，硝酸银等均为国产分析纯，购自兰州鹏程生物公司。

2.3基因组DNA提取

牦牛基因组DNA制备用常规酚/氯仿提取，并将提取的DNA置于－20℃保存备用。

2.4引物设计和PCR扩增

参考Yikun Guo[5]等设计的引物扩增LEPR基因第4外显子,引物由大连宝生物公司合成，引物序列上游为5′-ACTGTTGCCTCATTGTCT-3′，下游为5′-TAGGCACAACTTACCAAC-3′。反应体系：本试验PCR扩增采用20μL反应体系，其中ddH2O 15.2μL，10×Buf fer 2.0μL，dNTP混合物（浓度2.5 mM）0.3μL，引物（浓度10 pM）0.75μL，DNA模板（浓度50～150 ng）0.8μL，Taq酶（浓度5.0 U/μL）0.20μL。

PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s；55 oC退火30 s；72℃延伸45 s,共37个循环，最后在72℃终延伸10 min，4℃保存。

2.5 SSCP条件

2μL PCR产物和8μL加样缓冲液（98%甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氰、10 mmol·L-1 EDTA(pH8.0、10%甘油）混匀，98℃变性10 min，然后冰浴10 min，使之保持变性状态，最后点样电泳。实验中设计和分析了影响SSCP最重要的4个因素--凝胶浓度、交联度、电泳时间和甘油的添加程度。其中凝胶浓度分别为8.0%、10.0%和12.0%，交联度分别为29：1、39：1和49：1，电泳时间分别为15 h、20 h和25 h（见表1），甘油有添加和不加两种情况，使用的电泳槽胶板实际规格为:170 mm×170 mm×1.5 mm。以200 V电压在17℃（采用冷循环系统控温）1×TBE电泳液中电泳，采用Car los银染色法银染显色[6]。

表1 SSCP影响因素的实验设计表

3 结果与分析

3.1牦牛LEPR基因第4外显子PCR扩增图

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，发现本试验的引物用于PCR扩增都获得了很好的结果，片段长度与预期大小一致，而且没有非特异性扩增条带，可以直接进行SSCP检测（见图1）。

3.2牦牛LEPR基因第4外显子SSCP分析条件的优化

3.2.1凝胶浓度

在200V电压下，17℃电泳液中、交联度为29：1时，采用凝胶浓度分别为8.0%（图2）、10.0%（图3）和12.0%（图4）的凝胶电泳。结果表明在其他电泳条件不变的情况下，胶浓度为12%的凝胶电泳效果最好。

3.2.2交联度

在最佳凝胶浓度的研究中发现，12%的凝胶浓度电泳效果最好，所以其他实验条件固定在200V电压下，17℃电泳液、凝胶浓度12%下。分别使用交联度为29：1（图5）、39：1（图6）和49：1（图7）的胶进行电泳，分析最佳交联度。结果表明交联度为29：1的凝胶电泳效果最好。

3.2.3电泳时间

在12%的凝胶浓度、29：1的交联度下，分别用15 h、20 h和25 h进行电泳，结果表明电泳时间为25 h时条带最为清晰。

3.2.4甘油

实验发现，凝胶中不添加甘油，染色后条带更清晰。

3.2.5最佳优化条件

通过凝胶浓度、交联度、电泳时间和甘油的优化试验结果表明，在200V电压，17℃电泳液中，12%的凝胶浓度、29：1的交联度、不添加甘油和25 h的电泳时间为牦牛LEPR基因第4外显子的最佳PCR-SSCP试验条件（图8）。

4 讨论

PCR-SSCP是一项检测碱基突变、研究基因多态性的试验技术，优化SSCP分析条件、准确地对待检样品进行分析是进行多态性研究的前提。现就影响试验结果的主要条件如电压、凝胶浓度、交联度、电泳时间和甘油等因素展开讨论。

4.1 PCR的质量

扩增出的PCR产物特异性要好，产量要大。本人在实验过程中发现，扩增的有些PCR产物，在琼脂糖凝胶电泳检测时无非特异性条带，但聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率要远远高于琼脂糖凝胶电泳，在进行SSCP检测时，会出现许多杂带，影响基因型的判断，严重的致使无法判断目的片段，最终得重新设计引物进行PCR扩增。因此，PCR扩增的模板的质量关系到SSCP的成败，是重要的影响因素之一。本研究中扩增的PCR产物特异性好，用于SSCP分析获得了较好的结果。

4.2温度和电压、电泳时间

电泳温度是影响单链迁移速度和重复性高低的最关键的因素之一。在具体操作过程中，应自始至终保持电泳温度的相对恒定。电泳不恒温，凝胶散热快慢也受影响，直接影响到电泳时凝胶温度，而凝胶温度直接影响到单链构象的变化。凝胶温度改变，DNA单链构象也可能发生相应改变，其泳动速度也就不同。所以如果不控制凝胶温度，结果重复性差。本试验将电泳装置与冷循环系统连接，严格控制了电泳温度（17℃），所以实验的重复性和结果较好。

电压和电泳时间对SSCP分析的影响，应视不同的情况探索。本实验采用200V电压电泳，且在有冷却装置的电泳槽中进行SSCP，所以取得了很好的效果。根据实验结果，我们得出的经验是较低电压、较长时间没有坏处，在此基础上可以适当提高电压，缩短电泳时间。4.3非变性聚丙烯酰胺凝胶成分

聚丙烯酰胺凝胶成分也是影响SSCP检出率的因素之一，包括丙烯酰胺和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的比例，凝胶浓度、甘油的添加程度等。

凝胶浓度的变化对于检出不同长度片段中单碱基突变的敏感性很重要。其影响在于改变凝胶孔径及密度而使片段凝胶中的迁移率不同，而对于单链构象形成没有影响，会影响单链在凝胶中的迁移率而造成对不同片段的检出率差异。研究表明，较长的片段应使用较高的凝胶浓度，小片段使用较小的胶浓度，本试验也得出了相同的结论，用12%的凝胶浓度获得了较好的结果。

姜运良[7]认为对于较大的片段（≥200bp）一般采用较高交联度的凝胶（丙烯酰胺：N，N′-亚甲双丙烯酰胺=19：1或29：1）；对于≤200bp的片段则采用较低的交联度（丙烯酰胺：N，N′-亚甲双丙烯酰胺=39：1或49：1）。在本研究中，我们根据扩增片段的大小进行了摸索，该片段用29：1的交联度，发现较大的片段用较高的交联度，与姜运良的观点有一致之处。但还是应该根据实际的情况，制定不同的交联度。

对于添加甘油是否会影响SSCP检出率的报道并不一致。Fukuoko等[8]认为凝胶中加入5%的甘油可以提高检出率，姜运良[9]也认为对于100-200 bp范围内的DNA片段，10%-15%凝胶，丙烯酰胺与N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的比例为29：1时，凝胶中加入5%的甘油效果最佳。刘佳健等[10]认为凝胶中不加甘油的效果较好。在本研究中473bp的片段用29：1的交联度加入甘油，难以分辨不同的基因型，而不加甘油时，分辨率较好。凝胶中是否加甘油，对单链的迁移速度影响很大：有的片段，甘油对其迁移有促进作用，而有的片段，甘油则抑制其迁移，甘油的这种作用机制目前尚不清楚[11]。所以，凝胶中加不加甘油，如加甘油，多大浓度好，没有什么规律可循，只能靠实践来确定。

5 结论

实验结果表明凝胶浓度为12%，交联度为29：1，不添加甘油，17℃、1×TBE缓冲液中电泳25 h是牦牛LEPR基因第4外显子SSCP分析的最佳试验条件。

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