盐酸氨溴索对肺间质纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液头孢噻肟浓度的影响

陈 峰 张元霞 张才擎

盐酸氨溴索对肺间质纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液头孢噻肟浓度的影响

陈 峰 张元霞 张才擎

目的探讨盐酸氨溴索对肺间质纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)头孢噻肟浓度的影响。方法将54只Wister雄性大鼠随机分成3组，每组18只，正常对照组(A组)、模型组(B组)、盐酸氨溴索组(C组)，B、C组采用气管内注入博来霉素(5 mg/kg)的方法制作肺间质纤维化动物模型，A组气管内灌注生理盐水。C组每天腹腔内注入盐酸氨溴索35 mg/kg。分别于给药后第7、14、28天，各组每次取6只大鼠，鼠尾静脉注射头孢噻肟(600 mg/kg)后行支气管肺泡灌洗，灌洗液采用液相色谱—质谱联用法测定头孢噻肟的浓度，并取肺组织做病理观察。结果第7天C组BALF头孢噻肟浓度低于B组，差异无统计学意义(P=0.164)，第14天C组BALF头孢噻肟浓度上升，C组与B组的差异有统计学意义(P=0.000)。第28天C组锐降，低于B组，差异无统计学意义(P=0.126)。结论盐酸氨溴索可提高肺纤维化初期BALF中头孢噻肟的浓度。

肺间质纤维化； 盐酸氨溴索； 头孢噻肟

特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是特发性间质性肺炎最常见的一种，其发病原因不明，呈慢性、进行性、不可逆性发展，通常为致死性肺疾病[1]。其组织病理学或影像学表现符合典型的寻常型间质性肺炎(usual interstitual pneumonia, UIP)，确诊后的中位存活期为2.5～3.5年，生存期短，病死率高。缺血性心脏病、心力衰竭、支气管癌、感染和肺栓塞是特发性肺间质纤维化患者重要的死亡原因[2-9]。

特发性肺间质纤维化并发感染，可致呼吸功能下降，引起病情加重，动脉血氧分压进一步降低，积极控制感染，有利于改善肺功能，降低病死率[10]。

抗菌药物治疗的成功不仅要取决于致病微生物的敏感性，还要依赖感染组织中的药物浓度，抗菌药物的浓度在呼吸道感染治疗中尤其重要[11]。因此，提高支气管-肺组织中的抗菌药物浓度有利于控制感染。文献报道盐酸氨溴索可提高动物及人的正常肺组织中阿莫西林、红霉素、氨苄青霉素等抗菌药物的浓度[12-13]。盐酸氨溴索能否提高肺间质纤维化患者肺组织中抗菌药物浓度，增强疗效，改善患者预后，文献未见报道。研究表明支气管肺泡灌洗技术是适合于探测肺组织中抗菌药物浓度的方法之一，本研究在肺间质纤维化大鼠中，采用支气管肺泡灌洗技术，探讨盐酸氨溴索对肺组织中头孢噻肟钠的浓度的影响，旨在评价盐酸氨溴索对提高抗菌素在肺组织中浓度的作用[12]。

材料与方法

一、试剂与仪器

1.动物分组与模型制作 ：54只Wister雄性大鼠(清洁级)购自山东大学动物中心，体重180～220 g，随机分成3组每组18只，即正常对照组(A组)、模型组(B组)、盐酸氨溴索组(C组)，B、C组均一次性气管内注射博莱霉素(5 mg/kg)，A组气管内灌注生理盐水，C组每天腹腔内注入盐酸氨溴索35 mg/kg。各组分别于灌注博莱霉素后第7、14、28天，每次取6只大鼠，鼠尾静脉注射头孢噻肟(600 mg/kg)后行支气管肺泡灌洗，取灌洗液采用液相色谱—质谱联用法测定头孢噻肟的浓度。并取肺组织做病理观察。

2.标本取材和处理：10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉、固定后，自颈部分离出气管，在第三、四气管环间剪开气管，用5.5号头皮针(去针头)作为灌洗管置入管腔1 cm，用丝线结扎，将气管与灌洗管固定在一起，防止倒流，灌洗管内注入室温生理盐水2 ml，反复冲洗2遍，在灌洗抽注过程中注意速度缓慢，回收支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar fluids, BALF)至试管，灌洗液回收率>70%。灌洗液以离心半径8 cm，2000 r/min离心10 min，取上清液存入EP管，-20 ℃冰冻待检。取出双肺，用10%甲醛溶液固定1周后待病理检查。

二、检测方法

1. 病理检查方法：取右肺进行脱水、透明、浸蜡、切片、HE染色、封片，在普通显微镜下观察组织病理改变，评价肺泡炎症及肺纤维化的程度。分级标准:无肺泡炎症或肺纤维化(-)；轻度肺泡炎症或肺纤维化(+)，受累面积少于全肺20%；中度肺泡炎症或肺纤维化(++)，占20%～50%；重度肺泡炎症或肺纤维化(+++)，受累面积>50%。

2. 液质联合法测定肺泡灌洗液头孢噻肟钠浓度：①药品、试剂和标准溶液： 注射用头孢噻肟钠(苏州东瑞制药有限公司)，甲醇(色谱纯，美国TEDIA)，乙醇(色谱纯，天津利密欧)，水(娃哈哈纯净水)；②头孢噻肟钠储备液的配制 精密称取头孢噻肟钠10.06 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为1.0 mg/ml的储备液。

3. 仪器、 液相色谱系统：Agilent1100液相系统(包括四元泵、自动进样器、在线脱气机)，美国Agilent公司。MS/MS系统：Agilent1100Trap VL 型离子阱质谱仪，美国Agilent公司。数据采集系统：Agilent Chemstation a.09.03和Bruker质谱软件，美国Agilent公司。

4. 色谱条件： Zorbax SB C18分析柱(150×4.6mm I.D.，5μm)，美国Agilent公司。0.45μm在线过滤器，美国Agilent公司。流动相：甲醇：水(含0.1%乙酸)=30︰70(V/V)，流速：1.0 ml/Min，分流约0.3 ml/min进入质谱，进样量：5 μl，λ=254 nm。

5. 质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI源)，加热毛细管温度为350 ℃，喷雾气压力30psi，干燥气流量10 L/min。正离子方式检测，扫描模式为多反应离子检测(MRM)。用于定量分析的离子反应为m/z500→440，碎裂电压为0.8V。

6. 样品的处理: 量取BALF 100 μl，置5 ml塑料离心管中，加入400 μl甲醇，涡旋振荡0.5 min，以离半径8 cm，4000 r/min离心10 min，取上清液5μl进行分析。

7. 方法的专属性: 取10 μg/ml头孢噻肟钠甲醇对照液，离子源为电喷雾离子源(ESI源)，加热毛细管温度为325 ℃，喷雾气压力10 psi，干燥气(N2)流量4 L/min，使用灌注进样方式，流速5 μl/min，在正离子模式下，头孢噻肟钠主要生成[M+Na]+(m/z500)。选择性对[M+Na]+峰进行碎裂产物离子扫描，将头孢噻肟钠生成的主要碎片离子(m/z440)作为定量分析的产物离子。

8. 标准曲线: 精密量取头孢噻肟钠储备液(1.0 mg/ml)适量，加甲醇配成5、10、50 μg/ml的溶液，进样5μl分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制线性标准曲线，以标准曲线对样品进行定量(结果单位μg/ml)。

三、统计学方法

结 果

一、光镜下肺组织形态学改变

光镜下观察模型组第7天显示中至重度肺泡炎症，至第28天仅有轻度肺泡炎症；盐酸氨溴索组肺泡炎症较模型组减轻。模型组第14天开始出现纤维化，进行性发展至第28天达高峰，见图1；盐酸氨溴索组肺纤维化程度较模型组减轻，见图2。

图1 模型组第28天镜下表现(HE×400)

二、各组不同时间BALF头孢噻肟浓度的变化

模型组第7天BALF头孢噻肟浓度增高，至第14天浓度下降，28天有所回升，见表1、图3。与模型组相比，第7天盐酸氨溴索组BALF头孢噻肟浓度降低，差异无统计学意义(P=0.164)，见表2。第14天盐酸氨溴索组BALF头孢噻肟浓度上升，高于模型组，盐酸氨溴索组至与模型组的差异有统计学意义(P=0.00)，见表3。第28天C组锐降，低于模型组，差异无统计学意义(P=0.126)，见表4。

表1 各组大鼠不同时间BALF头孢噻肟浓度(μg/ml)

表2 第7天A组、C组BALF头孢噻肟浓度与B组两两比较(μg/ml)

表3 第14天A组、C组、D组BALF头孢噻肟浓度与B组两两比较(μg/ml)

表4 第 28天A组、C组支BALF头孢噻肟浓度与B组两两比较(μg/ml)

讨 论

特发性肺间质纤维化并发感染，可致呼吸功能下降，病情恶化，增加病死率。抗感染治疗成功的关键因素之一是感染组织中抗菌药物浓度，提高肺组织中抗菌药物浓度有利于控制感染，改善预后[10-11]。

头孢菌素是临床上常用的抗菌药物，其通过弥散机制进入支气管肺组织，本实验选用了头孢噻肟钠作为代表药物。实验发现，模型组第7天(肺泡炎期)BALF中的头孢噻肟浓度(10.63±2.19μg/ml)明显高于正常对照组(6.64±0.32μg/ml)(P=0.001)，这是因为模型组肺泡炎症期血管通透性增加所致[14]；模型组至第14天(纤维化初期)浓度下降，第28天(纤维化期)有所回升，与正常对照组相比差异均无统计学意义。

第7天(肺泡炎症期)，盐酸氨溴索组BALF中头孢噻肟浓度(9.09±2.14μg/ml)低于模型组(10.63±2.19μg/ml)，差异无统计学意义(P=0.164)；第8天(纤维化初期)，盐酸氨溴索组BALF中头孢噻肟浓度升高(14.39±3.21μg/ml)，高于模型组(8.33±2.34μg/ml)，差异有统计学意义(P=0.000)，对于在纤维化初期氨溴索提高抗菌药物的浓度的机制尚有待进一步研究；第28天(纤维化期)，盐酸氨溴索组BALF中头孢噻肟浓度低于模型组，两者差异无统计学意义(P=0.126)。

本研究发现氨溴索可提高纤维化初期BALF中头孢噻肟浓度的同时，还观察到盐酸氨溴索减轻纤维化的作用，这与文献报道相一致[15-16]。研究发现，盐酸氨溴索具有良好的抗炎、抗氧化作用，能抑制细胞因子及炎症介质的合成与释放[17-19]。氧自由基损伤是肺间质纤维化发生一个重要环节，本研究表明，盐酸氨溴索可使肺泡炎症、肺纤维化程度减轻。肺泡炎症期、纤维化期盐酸氨溴索组BALF中头孢噻肟钠浓度与模型组无统计学差别，纤维化初期高于模型组，提示纤维化初期盐酸氨溴索升高BALF中头孢噻肟钠浓度与其抗炎、抗纤维化作用有明显关系。

本实验结果表明盐氨溴索可提高纤维化初期BALF中头孢噻肟浓度，因而盐酸氨溴索在肺纤维化初期可以改善抗感染治疗效果，对于临床抗感染治疗有参考价值，对于盐酸氨溴索提高支气管肺泡中头孢噻肟浓度的机制尚有待进一步研究。

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11 Gené R, Poderoso JJ, Corazza C, et al. Influence of ambroxol on amoxicillin levels in bronchoalveolar lavage fluid[J]. Arzneimittelforschung, 1987, 37(8): 967-968.

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(本文编辑：张大春)

陈 峰，张元霞，张才擎. 盐酸氨溴索对肺间质纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液头孢噻肟浓度的影响[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2014， 7(5)： 528-531.

Effect of ambroxol on the concentration of cefotaxim in bronchioalveolar lavage fluid on rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

ChenFeng,Zhangyuanxia,Zhangcaiqing

(DepartmentofRespiration,ShandongProvinceQianfoshanHospital,Jinan250014,China)

Zhangcaiqing,Email:freezcq66@163.com

Objective To explore the effect of ambroxol on the concentration of cefotaxim in bronchioalveolar lavage fluid(BALF) on rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods A total of 54 Wister male rats were randomly divided into three groups, including normal control(Group A), model(Group B), ambroxol-treated(Group C). On experimengtal day(day 0), the rats was intratracheally instilled with bleomycin(5mg/kg body weght) or sterile saline, and then treated with the ambroxol(35 mg/kg) or sterile saline intraperitoneally respectively. On day 7, 14, 28 after instillation, six rats of each group were sacrificed and the bronchial alveolar fluids were recovered and the lung were gotted for histopathological examination after injected cefotaxim(600 mg/kg)intravenously. The concentration of cefotaxim in the BALF was assayed by liquid chromatography-mass spectrometry method. Results On 7th day the concentration of cefotaxim in the BALF of ambroxol group was lower than model group. On 14th day the concentration of cefotaxim in the BALF of ambroxol group was higher than model group. The deference between ambroxol group and model group was significant statistically(P=0.000). On 28th day the concentration of cefotaxim in the BALF of Ambroxol group decreased sharply, and was lower than model group(P=0.126). Conclusions Ambroxol can increase the concentration of cefotaxim in the BALF of the primary fibrosis stage.

Pulmonary fibrosis; Ambroxol; Cefotaxim

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2014.05.012

山东省科技攻关课题(2012GSF11830)

250014 济南，山东省千佛山医院呼吸科

张才擎，Email：chenfeng9322@sina.com

R563

A

2014-04-17)