金属基质蛋白酶在月经发生中的作用

徐祥波 ，刘书言，王乾兴 ，陈西华 ，张树成 ，贺 斌，王介东

(1.国家人口计生委科学技术研究所，北京 100081；2.广西医科大学，广西 南宁 530021； 3.遵义医学院，贵州 遵义 563099)

月经是灵长类月经动物所特有的生理现象。金属基质蛋白酶是月经发生中子宫内膜崩解的最终作用因子，因其在月经发生中的重要作用，本综述对金属基质蛋白酶基础结构、生化特征、调节机制以及在月经发生中相关的研究进展进行阐述。

1 金属基质蛋白酶结构与种类

金属蛋白酶其金属活性中心是Zn2+。1962年被首次发现，现今有200多个金属蛋白酶，根据其三维结构与进化包括40多个家族成员。MMP基因家族一般包括：前结构域，催化结构域，铰链区和血红素蛋白结构域。区别于其他的蛋白酶家族成员，MMP家族有三个分子特征：①与MMP1序列具有同源性；②在前结构域中具有半胱氨酸基序，PRCGXPD，此基序通过保守的半胱氨酸敖合锌离子活性位点使MMP以酶原的形式存在[1]。但是MMP23基因序列中并不存在此基序。③锌离子结合基序位于催化结构域的保守序列HEXGHXXGXXH中的3个组氨酸所结合，见图1[2]。

图1 MMP结构示意图

目前至少存在26个水解酶，包括四类：①胶原酶包括MMP1，MMP8和 MMP13，MMP18(非洲蟾蜍)，它们能够在胶原I，胶原II，胶原III距离N末端的3/4处特异的位点来剪切，释放出1/4和3/4长度的片段，也能够剪切其他的胞外基质和非胞外基质分子。②明胶酶包括MMP2(明胶酶A)和 MMP9(明胶酶B)，它们能够降解变性的胶原即明胶和基底膜胶原IV，V。在催化结构域存在3个纤维结合素的重复序列，此重复序列能够结合明胶，胶原和核纤层蛋白[3]。③间充质溶解素包括MMP3(间充质溶解素-1)和 MMP10 (间充质溶解素-2)，MMP3与MMP10有相似的底物，能够降解多糖，糖蛋白，纤维结合蛋白，核纤层蛋白，并且能够剪切基底膜胶原IV和胶原V，但是前者比后者有较高的蛋白水解效率[4]。 ④ 基质溶解因子为MMP7(基质溶解因子-1)和MMP26(基质溶解因子跨膜型酶(MT-MMP)。基质溶解因子缺少血红素蛋白结构域。⑤膜型MMP(MT-MMP)包括MT1-，MT2-，MT3-和MT4-MMP。MMP14、15、16和24 糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的MT5-和MT6-MMP (MMP17 和 25) MMP14能够消化胶原I，胶原II，胶原III和其他的胞外基质成分，并且能够将酶原形式转化为有活性酶的形式。⑥其它的MMP家族成员包括MMP11、12、 19、20、 22、23 和 28。MMP11 (间充质溶解素-3) 与 MMP3 (间充质溶解素-1)序列和作用的底物均不相同。MMP12(金属弹性蛋白酶)能够消化弹力蛋白和其他的蛋白。MMP20能够消化釉基质。MMP22首先从鸡成纤维细胞中克隆出来。MMP23缺少半胱氨酸基序和血红素蛋白结构域。MMP28是于2001年最晚发现的成员[5]。在子宫内膜中存在的MMP家族成员包括MMP1-3、MMP7、MMP9、MMP11、MMP13和MMP14。

2 MMP家族成员的剪切与活化

MMP酶原的激活需要血红素蛋白结构域的解离并需要其他的MMP家族成员或者其他的蛋白酶的共同作用。MMP3能够自身将酶原形式转化为活性酶，MMP3能够激活许多MMP家族成员的酶原，例如将MMP1和MMP9的酶原形式转化为活性酶MMP1和MMP9[6]，但是MMP2需要由MT-MMP来激活[7]。MT1-MMP介导MMP2酶原的激活需要TIMP2的作用下完成[8]。MMP7能够激活MMP-1的酶原变为其活性状态[9]。

3 MMP家族成员的调节

MMP-1在降解胞外基质中具有关键性作用，因此对其蛋白的精确调控是必要的，主要通过在转录水平和mRNA稳定性两方面的调控来实现。MMP1的编码区包括激活蛋白1和核因子κB (NFκB)反应元件[11]，致使孕酮和炎性因子(如IL-1和TNFα)都能影响MMP1的表达。

MMP1和MMP3具有与MMP2不同的启动子区[12]。NFκB 对于MMP1、MMP3和MMP9具有重要的调控作用，它和其它的转录因子共同作用能促进多种促炎症反应基因的表达，例如iNOS、TNFα、IL-1β、toll样受体-4和COX-2基因等[13-14]。孕酮能通过以下方式调控NFκB的表达：促进κBα抑制剂的表达，此蛋白结合NFκB使其留在核外而不发挥作用[15]；PR可与NFκB竞争性结合在基因启动子区[16]，促进TGFβ-1和孕酮协同抑制作用[17]。

中性粒细胞侵入到子宫内膜中是月经发生过程中一个重要的现象，其最终效应是促进子宫内膜的崩解和重建。中性粒细胞是MMP-8 (中性粒细胞胶原酶)和MMP-9 (明胶酶B)的主要来源，它拥有较高的更新率和1011细胞/天的生产力，因此目前认为，远远超过TIMPs的MMPs活性对于月经的发生是必需的[19]。

4 金属基质蛋白酶在月经中的作用

4.1 子宫内膜基质组成 子宫内膜的胞外基质能够行使两种功能：①它充当了组织的结构骨架。激素控制子宫内膜胞外基质的组成和生化机制的变化在成体的生理状态下是最迅速的。②它充当了信号的传递者。胞外基质通过整合素和其他受体与子宫内膜中的细胞之间相互作用，来介导细胞的黏附、生存、生长、迁移和分化等。在月经周期中，胞外基质的变化即胞外基质的崩解和重建是灵长类具有月经周期动物子宫内膜的一个显著特征。是胞外基质成分的生命周期包括基因的表达和调控，多肽的生物合成，亚基的结合，后翻译修饰，分泌，进一步的胞外修饰(特别是原胶原转化为成熟胶原)，组装成胞外基质，局部细胞功能的重建，随之而来的是被蛋白水解酶，胞吞作用以及溶酶体的多方面作用使其最后崩解。

胞外基质由胶原I、III、V、VI、XIII和原纤维蛋白组成。其主要成员为胶原I和胶原III。在灵长类和小鼠子宫内膜的胞外基质中均存在由大原纤维组成的胶原I、III、V，短链的胶原XIII，微原纤维组成的胶原VI和原纤维蛋白。在灵长类子宫内膜的胞外基质中大原纤维组成的胶原I存在于月经周期的增生期，分泌期和蜕膜化时期；胶原III同样存在上面所述的三个阶段，但是在蜕膜化的组织中，其含量比胶原I少；胶原V的表达量在蜕膜化时期增加，并且三者在蜕膜化时期持续表达[20]。

4.2 在月经发生过程中，早期认为降解胞外基质的三类酶 ①溶酶体酶，其原因为：1)在组织中存在有高度特异活性的酸性水解酶；2)在分泌晚期非沉淀的溶酶体成分增加[24]；3)细胞化学显示在月经前，胞外酸性磷酸酶存在于子宫内膜之中。这些结果与溶酶体的水解作用是相一致的，但是并不能证明在月经中参与了胞外基质的降解。②纤溶酶和纤溶酶原活化因子。人的子宫内膜中的尿激酶和组织纤溶酶原活化因子在月经期时增加，在体外培养的子宫内膜中，孕酮能够抑制两种纤溶酶原活化因子的分泌[25]，并且能够刺激间质细胞纤溶酶原活化因子抑制因子-1的表达[26]。表明在月经周期中激素能够调节纤溶酶原活化因子在月经前释放。纤溶酶原活化因子不但具有溶解纤维蛋白的作用，而且能够降解胞外基质的成分[27]和激活其他的酶，例如金属基质蛋白酶[28]。③金属基质蛋白酶(MMP)，能够降解胞外基质的大部分蛋白质[29]。大部分MMP以酶原的形式分泌，经过蛋白水解作用而被激活。a-巨球蛋白和组织金属蛋白酶抑制剂能够将所活性的形式转变为非活性形式。Courtoy PJ 研究小组于1996年，将人的子宫内膜组织块体外培养以模拟在月经期的变化。以网状纤维结构的完整性即利用网状纤维染色，相应的胶原抗体免疫组化和组织块中羟基脯氨酸的残余量作为衡量子宫内膜崩解和保持完整性的指标。在给予外源性的E2和P4，子宫内膜胞外基质保持完整；在不给予外源性的E2和P4，子宫内膜胞外基质崩解；在不给予外源性的E2和P4的处理组中加入各种酶的抑制剂。在加入4种不同MMP特异的抑制剂(RP, SC, BB, 和Ro)时，子宫内膜网状纤维保持完好。因此，体外培养研究表明，金属基质蛋白酶是诱导月经发生最重要的蛋白酶[35]。

4.3 MMP家族成员的定位，表达及酶活

4.3.1 MMP家族成员在月经周期中的人和猕猴子宫内膜中的定位和表达 MMP1在人和猕猴中的月经期和增生早期在子宫内膜功能层的间质细胞中表达[36-37]。Zhang J研究小组将人的子宫内膜间质细胞体外培养来模拟月经周期的黄体晚期，加入雌二醇和孕酮，细胞培养6 d后，孕酮撤退以模仿体内月经的发生。利用酶谱学方法和EMSA方法检测MMP的表达情况，发现MMP1的表达量增加，另外MMP-3和MMP-9的表达量也增加，MMP2的表达量没有变化[38]。Brenner RM研究小组将猕猴的卵巢切除，序贯性给予雌激素和孕酮，人工诱导猕猴的月经模型。孕酮撤退之后，MMP1 mRNA出现峰值，随后迅速下降，在孕酮撤退的第5天即早修复期，已经下降到基础值[37]。Papp CB研究小组研究了孕酮对蜕膜化间质细胞的影响，以及在加入雌二醇或者孕酮或者雌二醇和孕酮，利用Northern和ELISA方法研究间质细胞MMP的表达情况。单独加入雌二醇并没有影响MMP1酶原的分泌，然而同时在蜕膜化的间质细胞加入雌二醇和孕酮，利用 Northern杂交检测，抑制了MMP1 mRNA的表达(MMP2的表达并没有受到雌二醇和孕酮的影响)。雌二醇和孕酮的这种抑制作用在孕酮撤退即用米非司酮处理4 d后能够解除，MMP1 mRNA的表达是孕酮维持情况下的几倍。用ELISA方法进一步在蛋白质水平上证实了MMP1在孕酮撤退时表达量增加，而MMP2并不受到激素的影响[12]。

MMP2和MMP11同样在人和猕猴中的月经期和增生早期在子宫内膜功能层的间质细胞中表达。在人的子宫内膜组织块培养的体外模型中，孕酮能够抑制MMP2的表达，米非司酮能够解除这种抑制作用[36]。在人的子宫内膜间质细胞体外培养发现，孕酮的撤退能够诱导MMP2的上调[39]。在人工诱导猕猴月经模型中，免疫组织化学显示它们在脱落的间质细胞中有强表达，但在E2处理的10 d后消失。而在卵巢切除的动物中，在没有E2的情况下，MMP2能够持续表达14 d之久[37]。在人工诱导猕猴月经模型中，孕酮的撤退能够上调MMP11的表达，且能持续表达到增生期。

MMP3在月经期的间质细胞中存在[30]，在增生中期和分泌中期在局部水肿的间质细胞中弱表达。在猕猴中，在月经期后，表达量增加。在孕酮撤退的第2天即月经前期，在上层功能层的间质细胞特别是在腺体和螺旋动脉周围强表达。3 d后即早修复期，表达的部位具有局限性，主要在腔上皮下的间质细胞表达。Lockwood CJ研究小组同样利用了人的子宫内膜间质细胞体外培养模拟月经的发生。雌二醇和孕酮能够显著抑制蜕膜化间质细胞中MMP3的表达。但是单独加入雌二醇，并不能抑制其表达。孕酮的撤退能够解除这种抑制作用，从而促进MMP3的表达。因此MMP3可能在子宫内膜功能层脱落以前起着促进胞外基质降解的功能[40]

MMP7 mRNA在人和猕猴的月经期和增生期在子宫内膜上皮细胞中表达，在分泌早期和分泌中期并没有发现表达。在人工诱导的猕猴月经模型中，孕酮撤退的2 d后，MMP7 mRNA在上皮的细胞中表达增强，在雌激素处理的8～10 d仍然保持高表达。其蛋白质在腺上皮表达最强，在基底层和即将脱落的功能层弱表达。因此，MMP7似乎通过上皮细胞参与月经后胞外基质的重建[41]。

MMP9 mRNA仅仅存在于分泌晚期和月经期的间质细胞中[42]，另外在培养的间质细胞中孕酮的撤退能够产生MMP9的表达增加[36]。

MMP10在分泌晚期和月经期存在于子宫内膜的间质细胞中。在人工诱导的猕猴月经模型中，孕酮的撤退能够导致MMP10的上调，而在孕酮撤退的5 d后，降低到基础值。

4.3.2 在小鼠月经模型中MMP家族成员在月经期中的定位，表达和酶活Salamonsen LA研究小组利用小鼠生理性孕酮的撤退的月经模型，对MMP家族成员的定位和表达进行了研究[43]。MMP9和MMP7定位于白细胞特别是中性白细胞亚群。MMP3和MMP7在新修复上皮的附近表达丰富。利用两种抑制剂盐酸脱氧土霉素和巴马司他灌胃处理小鼠，通过原位酶谱学方法检测两种抑制剂能够有效的减少MMP的活性，但并不没有导致子宫内膜的崩解和修复。因此，研究人员暗示MMP虽然在人工诱导的小鼠月经模型中的子宫内膜存在，但是并不是这一过程的主要介导者。本实验室利用小鼠生理性孕酮撤退月经模型，在孕酮撤退的12 h回植孕酮，抑制pMMP-2、pMMP-3、MMP-9、pMMP-10 和pMMP-11的表达,孕酮撤退16 h回植孕酮，抑制pMMP-13的表达[44]。原位酶谱学检测，活性胶原酶在孕酮撤退12 h定位于蜕膜化区域的外周边界，在16 h，定位于中间坏死蜕膜化区域，明胶酶在孕酮撤退12 h同样定位于蜕膜化区域的外周边界[45]。将人的子宫内膜移植到小鼠中，续惯性给予雌激素和孕酮已模拟人的增殖期和分泌期，在孕酮撤退后，人的子宫内膜崩解的同时，MMP-1,MMP-2和MMP-9的表达量增加[46]。

5 展望

MMPs特异抑制剂的干预证实MMP是月经发生中子宫内膜崩解的最终作用因子，但在小鼠月经样模型中却发现MMP并不是其重要的介导者。MMPs在月经发生中的具体作用是什么？不同MMPs家族成员在灵长类月经动物以及小鼠月经样模型中的表达和定位，提示MMPs众多的家族成员参与了这一过程且执行不同的功能，但是哪一个MMP在月经发生中占主导地位以及不同的MMPs在这一过程中分别执行着什么功能？这些悬而未决的科学问题仍有待于进一步探索。

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