合成红藻氨酸对星形胶质细胞微丝表达及缝隙连接的影响

张 洁， 许 华

(1暨南大学药学院，广东 广州 510632； 2山西医学科学院，山西大医院药剂科，山西 太原 030032)

在神经组织所有胶质细胞中，星形胶质细胞(astrocytes, AST)数量最多，分布最广。AST不仅与神经元的功能活动及突触传递等多种正常生理活动有关，而且与神经系统内环境稳定的维持、神经组织的损伤与修复过程密切相关。近年来，星形胶质细胞在癫痫发病过程中作用也越来越受到人们的关注[1]。它的异常改变除涉及到细胞数量、形态、代谢活动、蛋白合成等方面外，其细胞间缝隙连接及与缝隙连接密切相关的细胞骨架蛋白的结构变化也与癫痫发病机制有关。 红藻氨酸(kainic acid, KA) 系红海藻海人草(Digeneasimplex)的提取物，与兴奋性氨基酸谷氨酸(glutamate, Glu)的结构相似，可诱发癫痫的发生，目前已被广泛用作动物癫痫模型造模剂，但其昂贵的价格影响了其在研究中的应用。本研究所用的合成红藻氨酸(synthetic kainic acid, SKA)，为KA的人工合成品。我们前期进行的动物实验证明，SKA腹腔注射可诱发Wistar大鼠癫痫发作，具有作用稳定、阶段性明显及死亡率较低的特点[2]。在此基础上，本文模拟神经元兴奋环境下, 即高浓度KCl 环境下，研究SKA对大鼠原代AST骨架微丝蛋白——纤丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)变化的影响，并使用细胞缝隙连接(gap junctions, GJ)通道阻滞剂1-庚醇(1-heptanol, 1-Hep)，探讨SKA对AST细胞缝隙连接的影响，旨在阐明SKA诱发大鼠癫痫的作用机制，以期从新的角度为癫痫的防治提供科学依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1动物 出生后24 h内的Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，购于中山医科大学实验动物中心，SPF级，实验动物资格认可证号为2006A072。

1.2药品及试剂 SKA由广州诺东生物科技有限公司提供，白色针状晶体，分子式：C10H15NO4·H2O，分子量为231.2；高效液相色谱法检测结果显示，其纯度大于99%。对照品KA购自Sigma，胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体购自广州仪涛科学仪器有限公司；DMED/F12培养液为Gibco产品；Cy3标记的抗兔IgG、DAPI和1-Hep均为Sigma产品；鬼笔环肽(rhodamine phallacidin R415)为Molecular Probes产品。

1.3主要仪器 LSM510 META激光共聚焦扫描显微镜(Carl Zeiss)；DMRA2型正立电动荧光显微镜(Leica)。

2 方法

2.1原代星形胶质细胞的获取 参照方法[3]，取新生24 h内的Wistar大鼠乳鼠，无菌操作下分离出乳鼠大脑，置于含有冷DMEM/F12培养基的培养皿中，剪碎组织，移入离心管中，按1∶1比例加入0.25%胰酶。15 min后终止消化，用200目滤网过滤，收集悬液，1 000 r/min离心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，轻轻吹打尽量使细胞分散存在；接种到25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。差速贴壁40 min，去除成纤维细胞；收集未贴壁的细胞以4×109/L密度加入到25 cm2培养瓶中，继续培养48 h后换液；此后每3 d换液(15%胎牛血清的DMEM/F12)1次，继续培养7～10 d，可有效去除神经元、神经前体细胞、血细胞等。

2.2正常大鼠星形胶质细胞的纯化及传代 上述原代细胞培养7～10 d，当细胞浓度达90%以上时，弃废液、漂洗、加入新鲜完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中2 h；继之于37 ℃、250 r/min恒温摇床振荡15～18 h，以去除少突胶质细胞；弃上清液，加入新鲜完全培养基，继续培养振荡后的贴壁细胞；次日取出，PBS漂洗3次，加入0.125%胰酶及0.04% EDTA，在37 ℃、5% CO2培养箱中消化2～3 min，镜下观察细胞收缩变圆时加入含胎牛血清的DMEM/F12终止消化，收集细胞悬液移入离心管，1 000 r/min离心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12，按1∶3传代。

2.3星形胶质细胞鉴定 GFAP是AST细胞的主要成分。利用GFAP抗体,采用免疫荧光组化技术对培养细胞中的星形胶质细胞进行鉴定[4]。

2.4实验分组及各组F-actin免疫荧光检测 在6孔板内培养星形胶质细胞时，于培养皿内放入载玻片(22 mm×22 mm)，制备细胞爬片。第7天待细胞将爬满整个玻片时换液，进行药物干预处理。将培养皿随机分成5大组，每组3皿，分别为正常对照组(培养基)、高浓度KCl组(KCl浓度为20 mmol/L )、高浓度KCl+SKA组(又分为SKA不同浓度亚组，分别为SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亚组)、高浓度KCl+1-Hep(1 mmol/L)组及高浓度 KCl+1-Hep+SKA组(又分为SKA不同浓度亚组，分别为SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亚组)。各组继续培养24 h后，用PBS轻轻冲洗各组已爬满细胞的玻片，加入FITC标记的鬼笔环肽(5 mg/L)，室温孵育1 h，对星形胶质细胞骨架蛋白F-actin进行直接免疫荧光染色[5]。将染色后的玻片置于激光扫描共聚焦显微镜下观察，每张玻片选择一个形态典型的星形胶质细胞进行断层扫描，获取三维图像，将图像存入计算机，用Image-Pro Plus软件进行荧光强度定量分析。

3 统计学处理

数据以均数±标准差 (mean±SD) 表示，用SPSS 13.0软件处理。采用方差分析进行组间差异比较，两两比较使用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AST细胞原代培养及鉴定

1.1AST细胞的原代培养及纯化 分离的大脑皮质细胞在种植24 h后大多已贴壁，34 d后细胞数量增多，胞体明显增大，部分细胞突起逐渐伸长。至7～10 d，细胞已长满培养瓶壁，倒置相差显微镜下可见细胞分2层：表层细胞胞体较小，三角形和梭形胞体居多，胞体周围有不同程度的光晕，突起多而细长；底层细胞形态相对较大，形态不规则，胞体暗，胞体周围光晕不明显，偶见突起。

利用摇床可使其它杂细胞脱落，经振荡纯化后，原代培养物中的表层细胞基本消失，细胞形态以胞体较大的细胞为主，底层细胞近于纯化。但随着细胞传代次数的增加，杂细胞生长迅速，AST细胞比例下降。因此，通过此法获得的AST细胞的最佳使用时间是2代以内的细胞。各时期细胞生长情况见图1A～C。

1.2GFAP免疫组化鉴定结果 结果显示，绝大多数细胞为GFAP阳性细胞，证明培养的细胞是AST细胞，镜下胞体呈红色、胞核显蓝色；而GFAP未表达细胞即非星形胶质细胞，仅可见其蓝色胞核，见图1D。

Figure 1. Primary astrocytes cultured for 24 h (A), 72 h (B) and 8 d (C), and identified by GFAP immunofluorescence staining (D).A,C: ×50; B,D: ×50.

2 SKA对AST细胞 F-actin表达的影响

2.1正常AST细胞F-actin形态学结构 镜下鬼笔环肽标记的F-actin呈橘红色，分布在细胞胞质，呈细束或细丝状，沿细胞极性平行排列，在细胞边缘处密集，镜下可见细胞边缘处荧光强度较强，逐层向内渐弱，见图2A；细胞突起部位F-actin呈现细丝状或曲而不直，整齐排列，似毛刺，各毛刺间距大致相等，见图2B，与非细胞突起区域笔直细线状形态差别较大，镜下可见其荧光强度较细胞内部的F-actin弱。

Figure 2. Morphology of F-actin in the normal astrocyte (phalloidin direct immunofluorescence staining, ×200).A: F-actin in the normal astrocyte;B: intercellular F-actin filopodia-like protrusions.

2.2SKA对F-actin形态学的影响 KCl作用于AST细胞24 h后，荧光强度较正常对照组增强，可见F-actin细丝状物比正常对照组明显密集，见图3A。同时给予KCl和SKA后，F-actin细丝状物数目增多、增粗、密集，荧光强度明显增强，表明SKA作用后F-actin表达增多，见图3B、C。给予KCl+1-Hep后F-actin表达明显降低，表现为细胞F-actin细丝状物稀疏，荧光强度弱于KCl组；而KCl+SKA+1-Hep组F-actin丝状线极细并愈加稀疏，有些荧光微弱，镜下难以辨认，见图3D。值得注意的是，所有1-Hep剂量组均可发现AST细胞内的F-actin部分呈细丝状断裂，其断端有长短不齐的细丝存在，见图3E；有些则似被横断，断面齐整,见图3F。SKA不同剂量分组镜下直接观察F-actin形态排布差异较小。

2.3SKA对F-actin表达量的影响 高浓度的KCl作用于星形胶质细胞24 h后，F-actin的荧光强度较正常对照组升高(P<0.01)；而给予KCl+SKA 24 h后F-actin的荧光强度较KCl组明显升高(P<0.01)，且不同浓度SKA亚组的结果显示，随SKA剂量增加，F-actin荧光强度逐渐增强，但各组间差异无统计学意义，见表1。

Figure 3. The effects of different treatments on the morphological changes of F-actin (×100).A: KCl group; B,C: KCl+SKA groups; D～F: KCl+SKA+1-Hep groups.

2.4SKA对GJ的影响 给予GJ通道阻滞剂1-Hep，可影响细胞间的联系，表现为KCl+1-Hep和KCl+SKA+1-Hep组的荧光强度均明显降低，KCl+SKA+1-Hep组的荧光强度降低更甚，见表1。我们推测SKA不仅具有稳定F-actin结构并抑制其解聚的作用，还可能促进了细胞间的GJ开放，增加了脑细胞间兴奋性的传递，引发癫痫的发作。

表1 SKA对AST细胞F-actin表达的影响

讨 论

近年来，星形胶质细胞、细胞骨架蛋白与癫痫关系的研究已经成为癫痫发病机制探讨的新热点。细胞骨架蛋白分为微管、微丝和中间丝3种类型。微丝是3种骨架蛋白中最细的1种，在细胞质中成束状平行排列或疏散成网状，主要由actin组装而成。而actin以F-actin和球状肌动蛋白 (G-actin) 形式存在并保持动态平衡[6]，参与细胞形态维持及细胞间紧密连接、细胞迁移等[7-8]。此外中枢神经系统内的GJ形成缝隙连接网，传导电活动，认为与癫痫的形成有关，而actin形态的完整性是决定GJ功能的基础[9-12]。

本研究所用SKA的致痫作用、作用机理等均同于KA。由于其结构和谷氨酸类似，可作用于脊椎动物中枢神经系统的Glu受体，既可直接兴奋神经元，又可增强细胞膜对钠离子的通透性而使神经细胞去极化。实验以高浓度的KCl作用于培养的AST细胞，模拟神经元兴奋时的细胞外环境，观察不同处理对AST细胞F-actin变化的影响。结果显示：(1) 高浓度KCl培养条件下，AST细胞F-actin免疫荧光强度比对照组增强，即F-actin含量增加。经GJ通道阻滞剂1-Hep作用后，细胞F-actin含量减少，提示F-actin含量变化与GJ之间可能存在某种关联，这种关联影响了细胞骨架微丝装配和细胞间信号传导，推测当神经元兴奋时，胞外呈高钾状态，细胞骨架actin发生重构，G-actin向F-actin转化，故F-actin含量增加。(2)高浓度KCl和SKA合用，AST细胞的F-actin免疫荧光强度较单独KCl组明显升高，提示SKA可能通过作用于AST细胞膜上的谷氨酸受体，致使细胞去极化，这种去极化状态引发细胞骨架微丝actin的转化或合成，F-actin增多。此结果和Zeng等[13]发现KA诱发小鼠癫痫后海马和大脑皮质F-actin相应减少的结果不相一致。(3) 已证明GJ阻滞剂具有抗癫痫作用[14]。本研究使用GJ通道阻滞剂1-Hep，使得SKA所致的F-actin荧光强度明显降低，推测SKA所致F-actin增多可能和GJ有关，是否SKA诱发癫痫作用和其引发GJ开放、促进了细胞间死亡信号的弥散有关[15]；另一方面F-actin荧光强度减少，是否是1-Hep降低GJ通透性或关闭GJ，AST细胞间通讯能力下降，而微丝的变化又与细胞间信息传导有关，这种信息导致F-actin解聚或向G-actin转化，显示为F-actin含量减少。

本研究还发现，KCl+SKA+1-Hep组F-actin形态的完整性遭到破坏，细胞微丝有断裂现象(图3F)，这恰好可从形态学角度解释GJ确实出现异常。但F-actin细丝出现整齐的横断面的原因还不清楚，这是否与1-Hep的自身特性有关，目前还不得而知。结果可见，加入1-Hep后，SKA组F-actin荧光强度降低，但其F-actin含量并不随SKA剂量变化而变化，推测原因可能是所选用1-Hep剂量足以阻断所用SKA剂量范围内所有GJ通道所致。

KA对神经元的损害作用已有大量实验研究，一般认为在使用1～50 μmol/L浓度时，KA对培养的神经元已产生神经兴奋毒性作用，增大到100～500 μmol/L时，开始具有细胞毒性作用，存在剂量依赖性关系[16]。但KA对神经胶质细胞，尤其是对星形胶质细胞的毒性作用报道极少。本实验结果显示，SKA的浓度在5～250 μmol/L的范围均可引起星形胶质细胞的F-actin表达增加，但量效关系不甚明显，其原因有待进一步研究。此外，GJ在癫痫的发生和持续中的作用及SAK对GJ的具体影响，值得进一步研究。

[参 考 文 献]

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