8周游泳运动对2型糖尿病大鼠周围神经病变的影响

尚画雨, 夏 志, 张 丹, 黄玫梅, 上官若男, 苏全生△

(1北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084； 2井冈山大学体育学院，江西 吉安 343009； 3四川省体育科学研究所，4成都体育学院，四川 成都 610041； 5成都大学体育学院，四川 成都 610106)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuro-pathy, DPN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的慢性并发症之一，在临床上表现为进行性的感觉功能缺失，随着病情的发展会出现疼痛、麻木甚至可能因坏疽而导致截肢[1]。目前，临床上主要通过药物治疗DPN，但值得考虑的是，长期服药不仅会产生毒副作用，且只能暂时应对部分问题，停药后疗效也无法持续。

引起DPN的发病机制有很多，近年来随着炎症学说的兴起和研究的增多，越来越多的学者趋向认为神经功能障碍主要是由于炎症反应引起[2-4]。运动与“胰岛素、饮食”一并被比喻为治疗DM的“三驾马车”。目前，国内外鲜见对炎症与DPN关系的研究，且尚未见报道从炎症反应的角度研究长期游泳运动在DPN发病中的干预作用。本研究拟通过对DPN模型大鼠神经组织病理学、坐骨神经中炎症因子和神经电生理的检测，探讨运动对T2DM大鼠坐骨神经损伤的保护作用及其可能机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)(Sigma)；ELISA试剂盒(成都三鹰生物技术有限公司)；血糖仪(美国强生公司)；PowerLab数据采集分析系统(AD Instruments)。

2 动物分组及模型制备

健康雄性Wistar大鼠45只，8周龄，体重200～230 g(四川大学华西医学院动物中心提供)。适应性喂养1周后，随机抽取14只分为空白对照组(C,n=7)和单纯运动组(CE,n=7)，给予标准大鼠饲料喂养7周后腹腔注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。其余31只给予高糖高脂饲料(10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸钠，66.5%常规饲料)喂养(期间死亡5只)，7周后空腹12 h腹腔注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mol/L、pH4.2的枸橼酸缓冲液中)。72 h后用血糖仪检测非禁食血糖>16.7 mmol/L者作为2型糖尿病(type II diabetes mellitus, T2DM)大鼠[5]。将20只成模大鼠(造模成功率为76.9%)随机分为2组：DM对照组(DM,n=10)和DM+运动组(DME,n=10)。

3 运动干预方案

采用改进的Ploug等[6]训练方案，池(100 cm×70 cm×60 cm)水深50 cm，水温(30±2)℃。先进行2次适应性游泳练习，每次10 min。第1周前3 d训练时间分别为20 min、30 min和45 min，第4天起每天持续游泳60 min，每周训练6 d，共训练8周。CE组和DME组进行训练，C组和DM组不予运动。

4 观察指标及检测方法

实验期间记录大鼠一般情况及行为改变，定时称重。分别于STZ注射前、运动8周后禁食12 h测量各组大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和空腹血清胰岛素(fasting insulin,FINS)。使用血糖仪测定FBG，ELISA测定血清FINS；胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

运动8周后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，俯卧位固定，迅速脱毛，仔细分离右侧从坐骨切迹至踝部的坐骨神经。坐骨神经分离暴露后立即测定，用生理盐水作为导电介质，以钩状电极作为刺激电极和记录电极分别置于坐骨切迹处和踝部，另将一个参考电极置于记录电极和刺激电极之间，大约位于腓肠肌处。测试时保持室温(25±1)℃，大鼠体温37 ℃左右，并连接PowerLab数据采集分析系统(频率20 Hz；单刺激方式；波宽1 ms；强度1.4 V；采样速率20 kHz)[7]。运动神经传导速度(motornerve conduction velocity,MNCV;m/s)=刺激电极与记录电极之间的距离(cm)×10/动作电位产生时间 (ms)，重复电刺激3次取平均值。MNCV测定后，取大鼠左侧坐骨神经(坐骨切迹至远端1 cm)，行HE染色。左侧剩余神经组织迅速置于液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱备用。ELISA测定坐骨神经中肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)含量。

5 统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。进行方差分析之前先进行方差齐性检验，若方差齐，则直接采用Bonferroni法进行事后检验，以使结论稳健而不保守；若方差不齐，则将原始数据转换至齐性后再作统计。对于不能转换至齐性的指标数据，直接采用Tamhane’s T2的统计结果进行分析。

结 果

1 一般情况

实验期间由于环境和饮食改变、糖尿病慢性疾病状态和感染等原因导致大鼠死亡。C、CE、DM和DME组最终进入统计的有效样本量分别为6只、6只、7只和6只。

成模大鼠毛色无光泽、精神萎靡，多饮、多食、多尿，明显消瘦。

2 体重的变化

适应性喂养1周后，14只标准饲料喂养大鼠体重[(242.00±34.52) g]与31只高糖高脂饲料喂养大鼠体重[(233.30±24.87) g]无显著差异。开始运动前C和CE组体重增加，DM和DME组体重减轻，各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)。实验末，C和CE组体重持续增加，组间差异无统计学意义(P>0.05)；DM组体重显著低于C组和CE组(P<0.01)；DME组体重较C组和CE组明显减轻(P<0.05)，较DM组增加并不显著(P>0.05)，见图1。

Figure 1. The change of body weight in diffe-rent groups at different time points. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group.

3 血糖的变化

实验期间C组和CE组的空腹血糖在正常范围内波动且组间差异无统计学意义(P>0.05)。DM和DME组在STZ注射前、开始运动前及运动后的空腹血糖均明显高于C组和CE组(P<0.01或P<0.05)。开始运动前，DM组和DME组的空腹血糖比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验末，与DM组相比，DME组的空腹血糖明显降低(P<0.05),见图2。

Figure 2. The change of fasting blood glucose (FBG) in diffe-rent groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

4 血清FINS和HOMA-IR的变化

实验期间C组和CE组的血清FINS和HOMA-IR均未发生明显变化，且组间差异无统计学意义(P>0.05)。在STZ注射前，DM和DME组的血清FINS和HOMA-IR高于C组和CE组(P<0.05或P<0.01)，但DM与DME两组间差异不显著(P>0.05)。实验末，DM组的血清FINS低于C组和CE组(P<0.01)，HOMA-IR高于C组和CE组(P<0.01)；DME组的血清FINS和HOMA-IR与C组和CE组相比无显著差异(P>0.05)，血清FINS显著高于DM组(P<0.01)，HOMA-IR明显低于DM组(P<0.05)，见图3、4。

Figure 3. The change of fasting insulin (FINS) in different groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group; ▲▲P<0.01 vs DM group.

Figure 4. The change of HOMA-IR in different groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.**P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

5 MNCV的变化

实验末，C组和CE组的MNCV差异无统计学意义(P>0.05)。DM和DME组的MNCV明显低于C组和CE组(P<0.01或P<0.05)；与DM组相比，DME组的MNCV显著提高(P<0.05),见图5。

Figure 5. The change of MNCV in different groups. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

6 坐骨神经形态学的变化

实验末，C组(图6A)和CE组(图6B)的坐骨神经有髓神经纤维形态正常，神经纤维排列紧密，髓鞘正常包绕在神经纤维轴索外。与C组和CE组比较，DM组(图6C)表现出神经损伤，髓鞘空泡变性，部分神经纤维脱髓鞘(如箭头所指)。DME组(图6D)较DM组改善明显，髓鞘空泡变性数量减少，极少神经纤维脱髓鞘。

Figure 6. The morphological change of sciatic nerve in different groups (HE staining, ×400). A: C group; B: CE group; C: DM group; D: DME group. Black arrows show myelin damage.

7 坐骨神经中TNF-α、IL-6和CRP的变化

实验末，C组和CE组TNF-α、IL-6和CRP的水平无明显差异(P>0.05)；与C组和CE组相比，DM组的TNF-α、IL-6和CRP水平明显升高(P<0.05)，而DME组的TNF-α、IL-6和CRP水平升高不显著(P>0.05)；DME组与DM组相比，虽然TNF-α、IL-6和CRP水平差异并不显著(P>0.05)，但仍表现出了下降的趋势，见表1。

表1 各组大鼠神经炎症因子比较

讨 论

近年来，大量研究结果表明T2DM可能是一种慢性临床炎症性疾病，由免疫系统诱导、细胞因子介导[8]。细胞因子不仅能够预测DM的发生[9-10]，而且与DM并发症如血管病变、肾病等有关[11-13]。这些炎症细胞因子主要包括急性时相反应蛋白CRP、TNF-α、IL-6等。研究指出：适宜的有氧运动，能明显提高血液纤维蛋白溶解酶活性，改善微循环，增加神经血流灌注，改善局部血液动力学，增强机体抗氧化反应，减轻炎症反应[14]。这为有氧运动治疗糖尿病并发症提供了理论依据。

本实验采用高糖高脂喂养联合小剂量STZ注射制备T2DM模型，我们发现当高糖高脂喂养7周后大鼠出现高胰岛素血症和胰岛素抵抗(insulin resis-tance, IR)，胰岛素抵抗指数升高，继以小剂量STZ破坏大鼠胰岛功能，出现高血糖。结果显示DM大鼠均呈现典型“三多一少”症状，毛色无光泽，体重明显减轻，从而进一步说明，本研究成功建立了T2DM大鼠模型，与国内外学者研究结果一致[15-16]。随后，我们观察了从T2DM发病到出现神经损害的完整过程，模拟了人类DPN发病情况和病理特征。神经传导速度(nerve conduction velocity,NCV)是诊断周围神经损伤的“金指标”，也是DPN重要的检查手段。很多实验制备DPN动物模型进行研究，结果表明，在DM早期即出现NCV明显减慢[17-18]。NCV包括MNCV和感觉神经传导速度(sensory NCV,SNCV)。其中，MNCV是最常用于研究实验性DPN模型的观察指标。本实验在大鼠成模后立即进行运动干预，结果表明，8周游泳运动不能将血糖降至正常水平，但能有效控制体重下降和血糖升高，还能增加胰岛素的分泌，从而改善IR。8周运动后DM组MNCV较C、CE组明显减慢(P<0.01)，而DME组与DM组比较明显提高(P<0.05)。提示8周游泳运动对T2DM大鼠MNCV减慢具有改善作用。另有资料表明，神经病变的发生同雪旺细胞与神经元轴突间的联系异常紧密相关。其中，髓鞘病变与神经传导速度有关，而轴突病变与诱发电位的波幅有关。光镜下我们观察到，DM组髓鞘空泡变性显著，部分神经纤维脱髓鞘。DME组干预后神经髓鞘空泡变性数量减少，极少神经纤维脱髓鞘，提示8周游泳运动能减轻T2DM大鼠周围神经损伤，延缓周围神经病变进程，与Balducci等[19]报道的长期运动训练可以改善DPN患者自然病程的结果相似。本研究还发现，T2DM大鼠8周时坐骨神经中炎症因子TNF-α、IL-6和CRP水平明显高于C和CE组(P<0.05)，表明此时的确处于慢性炎症状态，这与DM炎症发病学说是吻合的。在慢性炎症状态下，肝细胞可产生较多CRP。目前认为肝脏CRP产生的主要兴奋剂为IL-6。TNF-α诱导IL-6表达及其它通道激活，扩大级联反应，增加CRP的合成。FINS受体的活性受到CRP抑制，从而产生IR，再一次诱导TNF-α产生，进而加重炎症反应。CRP受TNF-α、IL-6等因子调控，刺激血管内皮因子释放，造成神经组织血流减少，缺血甚至坏死，引起神经传导速度减慢及周围神经损伤。本实验在8周运动干预后DME组坐骨神经中TNF-α、IL-6和CRP水平较DM组虽无明显差异(P>0.05)，但仍然表现出了降低的趋势，提示有氧运动可以抑制炎症反应，提高MNCV。

有氧运动对于TNF-α和CRP的影响报道不一[20-23]。这可能与不同的实验对象以及运动的时间和强度有关。Sloan等[24]研究发现12周中等强度(55%～60%最大心率)有氧运动后健康成年人TNF-α水平变化不大，只有12周高强度(75%～80%最大心率)有氧运动组TNF-α 出现显著下降。另有资料报道，TNF-α受体的水平比TNF-α更能反映TNF-α系统的活动[25]。另有研究结果显示有氧运动并不能降低TNF-α和CRP水平，但可以改善体适能[26-27]。You等[28]以绝经后肥胖妇女作为实验对象，对其进行6个月的节食联合运动干预，最后发现，节食联合运动干预可以使绝经后肥胖妇女CRP水平显著下降，提示从事有氧运动的同时需控制饮食，这样才能有效降低CRP水平。而IL-6未发生显著变化可能是8周的运动时间还不足以引起IL-6水平发生明显改变。本研究结果表明，8周游泳运动能通过降低炎症反应而减轻T2DM大鼠周围神经损伤。

综上所述，8周游泳运动可降低T2DM大鼠FBG水平，改善IR，提高MNCV，减轻DM造成的神经损伤，对周围神经起保护作用，其机制可能与减轻炎症反应有关。

[参 考 文 献]

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