番茄红素对小鼠肝纤维化的保护作用

赵凯

（江苏大学附属金坛医院消化科，江苏金坛213200）

番茄红素对小鼠肝纤维化的保护作用

赵凯

（江苏大学附属金坛医院消化科，江苏金坛213200）

目的：探讨番茄红素对刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）诱导的小鼠肝纤维化的干预作用。方法：24只小鼠随机均分为3组，对照组、模型组及预防组。模型组小鼠予以腹腔注射Con A（20 mg／kg），每周1次，对照组腹腔注射等量PBS溶液，预防组在注射Con A的同时予番茄红素灌胃（20 mg／kg），每天1次，8周后处死小鼠。收集血液检测肝纤维化指标，测定肝组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛水平，病理学及半定量计分系统（semi-quantitative scoring system，SSS）观察肝纤维化程度，免疫印迹法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Smad3蛋白、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达。结果：与对照组比较，模型组血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）水平，SSS计分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表达明显增加，SOD表达明显降低；与模型组相比，预防组HA、LN、PCⅢ水平，SSS计分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表达明显降低，SOD表达明显升高（P＜0.01）。结论：番茄红素通过减轻过氧化损伤，保护肝细胞，减少胶原生成，抑制α-SMA、TGF-β1及Smad3等致纤维化因子的表达，从而抵抗Con A诱导的肝纤维化作用。

番茄红素；肝纤维化；小鼠

脂质过氧化损伤能破坏肝细胞，促使肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖及活化，α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肝星状细胞活化的标志，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的致肝纤维化细胞因子之一，TGF-β1／Smad3信号通路在肝纤维化形成过程中起着重要作用。番茄红素是一种脂溶性不饱和碳氢化合物，类胡萝卜素的一种，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等作用。研究发现，番茄红素具有对抗实验小鼠肝纤维化作用［1］。我们采用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）腹腔注射昆明小鼠建立肝纤维化实验模型［2］，通过番茄红素干预治疗，检测小鼠肝纤维化指标、病理学改变、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛水平的变化及α-SMA、Smad3、TGF-β1的表达，探讨番茄红素抗小鼠肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 昆明小鼠由江苏大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（苏）2009-0002，动物使用许可证号：SYXK（苏）2008-0024。

1.1.2 主要药物及试剂 番茄红素（纯度99%）购自上海英轩医药有限公司，批号20110411；Con A购自Sigma公司，批号L-7647；SOD、丙二醛试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，批号20110726；α-SMA购自武汉博士德公司，批号BM002；Smad3兔多克隆抗体、TGF-β1兔多克隆抗体购自英国Abcam公司，批号分别为SC-8332、SC-146。

1.2 实验方法

24只小鼠随机分3组，每组8只。模型组小鼠予以腹腔注射Con A，20 mg／kg，每周1次，对照组腹腔注射等量PBS溶液，预防组在注射Con A的同时予番茄红素灌胃，20 mg／kg，每天1次。共8周。小鼠均摘除眼球取血，然后颈椎脱臼处死，取肝组织。

1.3 观察指标及检测

1.3.1 血清肝纤维化指标检测 采用放射免疫法检测透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）含量。

1.3.2 肝组织病理学检查 采用HE及Masson染色进行病理学检查，半定量计分系统（semi-quantitative scoring system，SSS）观察肝纤维化程度。

1.3.3 SOD和丙二醛测定 称取0.2 g肝组织配成10%组织匀浆液，10 000 r／min离心10 min，取上清测定SOD和丙二醛含量。

1.3.4 免疫印迹法检测α-SMA、TGF-β1、Smad3表达 取肝左叶同一部位组织，组织裂解液充分裂解，液态研磨，4℃，12 000 r／min离心10 min。SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，封闭2 h，加入α-SMA、TGF-β1、Smad3和β-肌动蛋白一抗，4℃孵育过夜。次日TBST充分洗膜3次，每次5 min，加入HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，洗去未结合的二抗，于暗室用ECL法检测反应产物，采用Quantity One图像分析系统分析各条带平均灰度值，以目的条带灰度值与内参照β-肌动蛋白灰度值的比值表示α-SMA、TGF-β1及Smad3的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 番茄红素对肝纤维化血清学指标的影响

见表1，与对照组比较，模型组HA、LN、PCⅢ表达均明显升高（P均＜0.01）；与模型组比较，预防组HA、LN、PCⅢ表达明显降低（P均＜0.01）。

表1 各组肝纤维化血清学指标的比较n＝8，±s

表1 各组肝纤维化血清学指标的比较n＝8，±s

a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.01，与模型组比较

组别 HA（μg·L－1）LN（μg·L－1）PCⅢ（μg·L－1）对照组64.00±12.17 73.13±10.53 66.38±7.96模型组432.50±28.53a 133.13±10.38a 231.88±15.83a预防组121.88±23.03b 87.00±7.82b 90.00±6.32b F值631.54 84.58 543.08 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 小鼠肝脏组织病理变化

如图1所示，对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，无纤维增生；模型组多数肝小叶破坏、结构紊乱，汇管区扩大，中央静脉外周有纤维条索向外周延伸，部分区域出现纤维间隔；预防组肝小叶结构完整，可见炎细胞浸润，小叶内见点灶状坏死，少量纤维组织增生。

对照组、模型组和预防组SSS计分分别为（0.75±0.46）分、（7.38±1.19）分和（2.38±0.92）分，3组间差异有统计学意义（F＝116.11，P＜ 0.01）；模型组SSS计分明显高于对照组和预防组 （P＜0.01）。

图1 各组小鼠肝组织病理结构（×200）

2.3 番茄红素对肝组织中SOD和丙二醛的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组SOD表达明显降低、丙二醛表达明显升高（P均＜0.01）；与模型组比较，预防组SOD表达明显升高、丙二醛表达明显降低（P均＜0.01）。

表2 各组小鼠肝组织SOD和丙二醛的比较n＝8，±s

表2 各组小鼠肝组织SOD和丙二醛的比较n＝8，±s

a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.01，与模型组比较

组别 SOD（U·mg－1） 丙二醛（nmol·mg－1）对照组113.88±8.53 1.16±0.23模型组 63.38±10.58a 3.39±0.31a预防组 103.38±13.00b 1.49±0.12b F值48.20 208.63 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各组小鼠肝组织α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表达

α-SMA、TGF-β1及Smad3在模型组中呈高表达，而在对照组及预防组中呈低表达（α-SMA：F＝272.53；TGF-β1：F＝147.08；Smad3：F＝118.58，P均＜0.01）。与对照组比较，模型组α-SMA、TGF-β1及Smad3的表达明显升高；与模型组比较，预防组α-SMA、TGF-β1及Smad3的表达明显降低（P均＜0.01）。见图2、图3。

3 讨论

图2 免疫印迹法检测α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表达

图3 各组小鼠肝组织α-SMA、TGF-β1及Smad3相对表达量

肝纤维化发生的关键是HSC的激活和细胞外基质（ECM）的过度沉积。脂质过氧化是肝脏炎症损伤发展至肝纤维化的桥梁，自由基以及脂质过氧化物直接刺激或通过旁分泌刺激HSC使其活化，诱导肝纤维化的发生［3］。丙二醛是脂质过氧化的产物，反映自由基对肝细胞的损伤程度，SOD能清除超氧阴离子等自由基保护细胞免受损伤［4］。当肝脏受到物理、化学及生物因素刺激时，HSC增殖并激活，转变为肌成纤维细胞，通过旁分泌和自分泌合成大量的ECM，并表达α-SMA［5］。α-SMA是HSC活化及肌成纤维细胞激活的特征性标志物［6］。近年来针对TGF-β1／Smad3研究药物抗肝纤维化作用已成为纤维化防治的热点［7－8］。作为最重要的致肝纤维化细胞因子之一，TGF-β1能够抑制肝细胞的增殖，激发HSC的活化，促进ECM的产生［9］。TGF-β1信号传导通路中的关键因子Smad3是HSC活化的重要媒介，减少Smad3的激活是下调Ⅰ型胶原表达的关键步骤［10］，而Smad3缺失能够对抗肝脏纤维化［11］。

本实验通过ConA腹腔注射昆明小鼠建立肝纤维化模型，结果显示模型组HA、LN及PCⅢ明显增高，肝组织病理学及SSS计分符合肝纤维化表现，说明造模成功。预防组血清肝纤维化指标下降，病理学改善明显，进一步证实番茄红素具有抗肝纤维化作用。此外，通过番茄红素干预可明显增加SOD含量，降低丙二醛含量；小鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、Smad3的水平明显降低，提示番茄红素能减轻过氧化损伤，保护肝细胞，减少胶原生成，并能抑制重要的致纤维化因子α-SMA、TGF-β1及Smad3的表达，具有良好的抗纤维化作用。

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Protective effect of lycopene on hepatic fibrosis in m ice

ZHAO Kai
（Department of Gastroenterology，Jintan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200，China）

Objective：To investigate protective effect of lycopene on liver fibrosis in mice induced by concanavalin A（Con A）.M ethods：Twenty-four mice were equally randomized into 3 groups：control group，model group and prevention group.Themice inmodel group was received intraperitoneal injection of CoA（20 mg／kg），one time per week，while control group received normal saline，prevention group was received intragastric administration of lycopene，one time per day，for 8 weeks.Mice blood were collected to test the indices of hepatic fibrosis.Grade of hepatic fibrosiswere evaluated according to the semi-quantitative scoring system（SSS）.Western blotting was used to test the expression ofα-smooth muscle actin（α-SMA），Smad3 protein（Smad3）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）.Results：Compared with the control group，themodel group showed higher serum levels of hyaluronic acid（HA），laminin（LN），procollagen typeⅢ（PCⅢ），SSSscore，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，lower superoxide dismutase（SOD）（both P＜0.01）；compared with the model group，the prevention group showed lower serum levels of HA，LN，PCⅢ，SSS score，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，higher levels of SOD（both P＜0.01）.Conclusion：Lycopene could sharply decrease the harm of peroxidation，protect the liver cells，reduce the collagen production and restrain the expression of the important factor ofα-SMA，Smad3，TGF-β1which lead to liver fibrosis，so that lycopene had the notable alleviate effect on liver fibrosis induced by ConA.

lycopene；hepatic fibrosis；mice

赵凯（1974—），男，江苏金坛人，副主任医师，主要从事肝脏疾病的基础和临床研究。

R575.2

A

1671－7783（2014）04－0290－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140157

金坛市科技局计划项目（TS2010073）

2014－05－01 ［编辑］刘星星