NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌组织中的表达及临床意义

焦霞，朱晓蔚*，蒋小芹，赵国军，詹树东，刘福兴，戴桂红，肖蔚，姜家宝，于鸿

（泰州市人民医院1.病理科，2.普外科，江苏泰州225300）

NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌组织中的表达及临床意义

焦霞1，朱晓蔚1*，蒋小芹1，赵国军1，詹树东1，刘福兴1，戴桂红1，肖蔚1，姜家宝2，于鸿1

（泰州市人民医院1.病理科，2.普外科，江苏泰州225300）

目的：观察N-myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）、P21及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因在肺腺癌中的表达及在肺腺癌发生、发展中的作用及意义。方法：应用免疫组织化学法检测20例正常肺组织和94例肺腺癌组织中NDRG1、P21及VEGF蛋白的表达情况，并分析三者表达与临床病理参数及患者预后的相关性。结果：在正常肺组织及肺腺癌组织中，NDRG1阳性率分别为90.0%（18／20）和52.1%（49／94），P21阳性率分别为80.0%（16／20）和33.0%（31／94），VEGF阳性率分别为20.0%（4／20）和53.2%（50／94），3种蛋白阳性率比较差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。肺腺癌组织中NDRG1、P21及VEGF的表达与肺腺癌患者年龄、性别、组织分化程度及TNM分期均无相关性（P均＞0.05），而与淋巴结转移明显相关（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，NDRG1、P21和VEGF表达与生存明显相关（P均＜0.01）。结论：肺腺癌组织中NDRG1和P21表达下调，而VEGF表达上调，联合检测三者的表达可能对判断预后具有重要价值。

肺腺癌；N-myc下游调节基因1；P21；血管内皮生长因子

N-myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）是Stanton等［1］在N-myc敲除的小鼠胚胎组织中发现的，与细胞增殖及分化密切相关，可被多种生理或病理因素诱导和调控，与多种恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及预后密切相关。近来研究发现，NDRG1在宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达降低或缺失，有望成为一个新的候选抑癌基因，已引起越来越多研究者的重视［2］。然而，迄今对于NDRG1在肺腺癌发生发展中的作用机制及临床意义尚不十分明确。为此，本研究应用免疫组织化学法观察肺腺癌组织和正常肺组织中NDRG1、P21及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，分析三者阳性表达的相关性及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2005年1月至2009年12月泰州市人民医院胸外科手术切除肺腺癌蜡块标本94例，男56例，女38例，年龄34～86岁，平均56岁，其中＜55岁30例，≥55岁64例；所有病例均经病理学检查证实为腺癌，高分化16例，中分化51例，低分化27例。根据2009年国际抗癌协会制定的TNM临床分期标准进行分期，Ⅰ期40例，Ⅱ期36例，Ⅲ期18例。伴有淋巴结转移44例，无淋巴结转移50例。所有病例术前均未经放疗、化疗。收集20例正常肺组织作为对照。

1.2 方法

免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶复合物法（S-P法）。羊抗人NDRG1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗人P21单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体购自丹麦Dako公司，具体操作流程按说明书进行，以PBS替代一抗作为阴性对照。结果判断：NDRG1蛋白阳性信号定位于细胞质或细胞膜，棕黄色颗粒为阳性表达；VEGF以细胞质内见均匀棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达；P21阳性信号定位于胞核，棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。根据阳性细胞数和着色强度用半定量积分法判断结果，每张切片阳性细胞数＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；着色强度：细胞不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者积分相乘，0～4分为阴性，5～12分为阳性［3－4］。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用χ2检验分析肺腺癌组织与正常肺组织中NDRG1、P21和VEGF的表达及肺腺癌组织中三者表达与临床病理特征之间的关系。采用Spearman相关系数计算肺腺癌组织中三者阳性率的相关性。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank检验法分析生存率差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织中NDRG1、P21及VEGF的表达

正常肺组织肺泡上皮中NDRG1蛋白阳性表达率为90.0%（18／20），肺腺癌组织中NDRG1蛋白阳性表达率为52.1%（49／94）。与正常肺组织相比，肺腺癌组织中NDRG1蛋白表达明显下调（χ2＝9.762，P＝0.002）。正常肺组织中肺泡上皮P21阳性表达率为80.0%（16／20），肺腺癌组织中P21阳性表达率为33.0%（31／94）。与正常肺组织相比，肺腺癌组织中P21表达明显下调（χ2＝13.170，P＝0.001）。正常肺组织中VEGF阳性表达率为20.0%（4／20），肺腺癌组织中VEGF阳性表达率为53.2%（50／94）。与正常肺组织相比，肺腺癌组织中VEGF表达明显上调（χ2＝6.017，P＝0.014）。见图1。

2.2 NDRG1、P21及VEGF的表达与临床病理参数的关系

肺腺癌组织中NDRG1、P21及VEGF的表达与患者年龄、性别、组织分化程度及TNM分期均无相关性（P均＞0.05），而与淋巴结转移明显相关（P＜0.05）。见表1。

2.3 肺腺癌组织中NDRG1、P21和VEGF表达的相关性分析

94例肺腺癌组织中，22例NDRG1与P21同时呈阳性表达，40例同时呈阴性表达；17例NDRG1与VEGF同时呈阳性表达，16例同时呈阴性表达；10例VEGF与P21同时呈阳性表达，23例同时呈阴性表达。Spearman等级相关分析显示，NDRG1与P21在肺腺癌中的表达呈正相关（r＝0.324，P＝0.001），NDRG1与VEGF在肺腺癌中的表达呈负相关（r＝－0.296，P＝0.002），VEGF与P21在肺腺癌 中的表达呈负相关（r＝－0.294，P＝0.002）。

图1 免疫组织化学检测NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌组织和正常肺组织中的表达（SP×200）

表1 NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌中的表达及其与临床病理参数的关系

2.4 肺腺癌组织中NDRG1、P21和VEGF表达与肿瘤预后的关系

94例肺腺癌患者中80例获得随访资料，电话随访5年，38例患者死亡，整体5年存活率为52.5%。总平均生存时间为43.74个月，总中位生存时间为43个月。Kaplan-Meier生存分析结果显示，肺腺癌组织中NDRG1及P21表达阳性者较阴性者生存期长，而VEGF表达阳性者较阴性者生存期缩短。见图2。

3 讨论

研究发现，NDRG1在乳腺癌、宫颈癌、肝癌等组织及人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW62细胞内表达明显降低［5］。Fotovati等［6］报道，乳腺癌组织内NDRG1表达明显降低，且表达水平越低癌转移率越高、患者生存时间越短。Li等［7］将NDRG1导入高转移性结肠癌SW620细胞系中，观察到其体外侵袭能力及在裸鼠体内肝脏转移能力明显降低，提示NDRG1是一种转移抑制基因。本实验结果显示，肺腺癌组织中的NDRG1表达明显低于正常肺组织，证实NDRG1在肺腺癌组织内表达明显减少。本研究淋巴结转移组的NDRG1阳性表达率明显低于无淋巴结转移组，提示NDRG1表达减少与肺腺癌的进展及转移有关。

图2 NDRG1、P21、VEGF表达与患者生存时间的关系（Kap lan-M eier生存分析）

P21蛋白是目前已知的具有广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，其过表达致细胞周期阻滞于G1期、G2期或S期，从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Kovacevic等［8］将NDRG1基因导入人前列腺癌PC3MM细胞株和肺癌H1299细胞株，结果显示细胞增殖及转移能力均降低，其机制可能与NDRG1通过非P53依赖性信号通路在转录和转录后水平调节P21的表达有关。我们前期采用脂质体介导将NDRG1基因转染人肺腺癌A549细胞株，发现该转基因细胞P21表达也上调，细胞增殖水平明显降低而细胞凋亡明显增加，其机制可能与NDRG1上调A549细胞P21的表达有关［9］。VEGF是目前已知作用最强的血管内皮生长因子，主要功能是促进血管内皮细胞增殖，诱导新生血管形成，促进肿瘤细胞生长和转移。研究显示，体外培养的肺癌细胞、动物模型的肺癌组织及人肺癌组织中VEGF均呈高表达［10］。Hosoi等［11］报道，上调胰腺癌与肺腺癌细胞内NDRG1基因的表达，癌细胞的增殖、侵袭及转移能力明显降低。本实验结果显示，NDRG1和P21蛋白在肺腺癌中表达下调，而VEGF表达上调，NDRG1和P21阳性表达患者的淋巴结转移率较低，NDRG1、P21和VEGF表达与患者预后明显相关。因此，我们认为NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌中表达的联合检测对判断肺腺癌转移及预后具有一定意义。同时，肺腺癌组织中NDRG1、P21与VEGF的表达具有相关性，提示NDRG1可能与P21、VEGF协同作用，参与肺腺癌发生和发展。

［1］Stanton BR，Perkins AS，Tessarollo L，etal.Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop［J］.Genes Dev，1992，6（12A）：2235－2247.

［2］Fang BA，Kovacˇevic＇Ž，Park KC，et al.Molecular functions of the iron-regulated metastasis suppressor， NDRG1，and its potential as amolecular target for cancer therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1845（1）：1－19.

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［6］Fotovati A，Abu-Ali S，Kage M，et al.N-myc downstream-regulated gene 1（NDRG1）a differentiation marker of human breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2011，17（3）：525－533.

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［9］焦霞，朱晓蔚，李顺龙，等.上调NDRG1基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响［J］.江苏大学学报：医学版，2013，23（5）：402－406.

［10］Goel HL，Mercurio AM.VEGF targets the tumour cell［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（12）：871－882.

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Expression of NDRG1，P21 and VEGF in lung adenocarcinoma tissue and its clinical significance

JIAO Xia1，ZHU Xiao-wei1，JIANG Xiao-qin1，ZHAO Guo-jun1，ZHAN Shu-dong1，LIU Fu-xing1，DAIGui-hong1，XIAOWei1，JIANG Jia-bao2，YU Hong1
（1.Department of Pathology，2.Department of General Surgery，Taizhou People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Objective：To observe the expression of N-myc downstream regulated gene1（NDRG1），P21 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in lung adenocarcinoma tissue，and to elucidate themechanism of lung adenocarcinoma invasion and metastasis.M ethods：The expressions of NDRG1，P21 and VEGF were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal lung tissue and in 94 cases of lung adenocarcinoma tissue.The correlation among NDRG1，P21 and VEGF expressions in lung adenocarcinoma tissue was investigated by Spearman rank correlation analysis.The relationship between NDRG1 expression and clinicopathological characteristics was investigated by Kaplan-Meier survival curve analysis.Results：In normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue，the positive immunoreactivity rate of NDRG1 was 90.0%（18／20）and 52.1%（49／94），respectively；P21 was 80.0%（16／20）and 33.0%（31／94），respectively；VEGF was 20.0%（4／20）and 53.2%（50／94），respectively.The expressions of NDRG1 and P21 was negatively correlated with lymphaticmetastasis，while the expression of VEGFwas positively correlated with lymphatic metastasis.Univariate survival analysis indicated that the expressions of NDRG1，P21 and VEGF were associated with patient survival.Conclusion：The expressions of NDRG1 and P21 in lung adenocarcinoma tissuewere down-regulated while VEGF expression was up-regulated.The joint detection of NDRG1，P21 and VEGFmight provide some guiding significance to judge the prognosis of lung adenocarcinoma.

book=347,ebook=76

lung adenocarcinoma；N-myc downstream regulated gene 1；P21；vascular endothelial growth factor

R734.2

A

1671－7783（2014）04－0346－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140102

江苏省六大人才基金资助项目（2011-WS-023）；泰州市人民医院重大科研资助项目（201008）

焦霞（1979—），女，江苏泰州人，主治医师，硕士，主要从事肺肿瘤研究；肖蔚（通讯作者），教授，主任医师，E-mail：yuhongmiaomiao＠163.com

*：共同第一作者

2014－04－15 ［编辑］刘星星