类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中糖酵解相关基因的表达

熊御云，王蓓，陶真，吴玲，尤海燕，王文红，焦志军

（江苏大学附属医院1.检验科，2.风湿科，江苏镇江212001；3.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中糖酵解相关基因的表达

熊御云1，王蓓1，陶真1，吴玲2，尤海燕1，王文红3，焦志军1

（江苏大学附属医院1.检验科，2.风湿科，江苏镇江212001；3.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：探讨糖酵解相关基因在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的表达及其意义。方法：选取活动期RA患者19例，稳定期RA患者23例，采用Ficoll法分离PBMC，定量PCR检测糖酵解相关基因表达水平，并与健康对照进行比较。结果：与健康对照相比，活动期RA患者PBMC中糖酵解相关基因丙糖磷酸异构酶（triosephosphate isomerase，TPI）、烯醇化酶（enolase，ENO）、M型丙酮酸激酶（pyruvate kinasemuscle，PKM）、单羧酸转运蛋白（monocarboxylic acid transportermember，MCT）表达量均增加（P＜0.05），稳定期RA患者4种基因的表达略有升高，但差异无统计学意义。结论：RA患者存在糖酵解相关基因表达的改变。糖酵解反应有可能在RA疾病机制中具有重要的意义。

类风湿关节炎；定量PCR；糖酵解相关基因；外周血单个核细胞

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性全身性疾病，以关节滑膜炎为主要特征。研究发现RA患者的滑膜细胞中糖酵解活性增强［1］，但尚未见有关RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中糖酵解相关基因表达研究的报道。本研究采用定量PCR分析糖酵解相关基因如丙糖磷酸异构酶（triosephosphate isomerase，TPI）、烯醇化酶（enolase，ENO）、M型丙酮酸激酶（pyruvate kinase muscle，PKM）、单羧酸转运蛋白（monocarboxylic acid transportermember，MCT）等基因的表达，以期为研究糖酵解在RA疾病过程中的作用提供初步的信息。

1 对象与方法

1.1 对象

本院活动期RA患者19例（均为女性，年龄45～68岁，平均58岁），稳定期RA患者23例（均为女性，年龄39～71岁，平均52岁），均严格按照2010年ACR／EULAR诊断分类标准进行筛选。活动程度按照患者疲劳的严重性，晨僵持续的时间，关节疼痛和肿胀的程度，关节压痛和肿胀的数目，关节功能受限制程度以及实验室诊断指标（如血沉、C反应蛋白、类风湿因子和抗CCP抗体检测）等进行判断。年龄和性别相匹配的21例健康献血员（均为女性，年龄50～69岁，平均61岁）作为健康对照组。

1.2 主要试剂

淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，RNA抽提试剂Trizol为Life Technologies公司产品，逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT-PCR和PCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）为TaKaRa公司产品。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分离 静脉血5 mL EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度离心分离法分离PBMC，1 500 r／min离心20 min吸取中间PBMC（白色云雾层），加PBS洗涤细胞2次，1 500 r／min离心10 min，弃上清，加1 mL Trizol充分溶解，－70℃冰箱保存。

1.3.2 总RNA抽提及逆转录反应 PBMC中总RNA的提取利用Trizol试剂进行。按照Prime-ScriptTMRT-PCR试剂盒的操作步骤进行逆转录反应合成cDNA。

1.3.3 定量PCR检测糖酵解相关基因mRNA表达

采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时定量PCR操作。引物由上海英骏生物工程有限公司合成，糖酵解相关基因及内参引物序列见表1。表达水平以其与内参β-肌动蛋白的比值表示，定量PCR仪型号为Stratagene公司Mx3000P。

表1 糖酵解相关基因及内参引物序列

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，进一步两两比较采用Nemenyi法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者PBMC中TPI mRNA的表达

如图1所示，TPI mRNA在RA患者与健康对照组PBMC中均有表达。活动期RA患者中TPI mRNA表达水平比健康对照组明显增高，增加了约6.6倍，差异有统计学意义（χ2＝4.994，P＜0.05）。稳定期RA患者与健康对照组相比TPI mRNA略有升高，但差异无统计学意义。

图1 类风湿关节炎患者PBMC中TPI mRNA的相对表达水平

2.2 RA患者PBMC中ENO mRNA的表达

如图2所示，活动期RA患者中ENO mRNA表达水平比健康对照组明显增加，差异有统计学意义（χ2＝9.603，P＜0.05），稳定期RA患者与健康对照组相比差异无统计学意义。

图2 类风湿关节炎患者PBMC中ENO mRNA的相对表达水平

2.3 RA患者PBMC中PKM mRNA的表达

如图3所示，活动期RA患者PKM mRNA表达水平比健康对照组增加了154倍，差异有统计学意义（χ2＝19.134，P＜0.001）。稳定期RA患者PB-MC中PKM的表达与健康对照组相比差异无统计学意义。

图3 类风湿关节炎患者PBMC中PKM m RNA的相对表达水平

2.4 RA患者PBMC中MCT mRNA的表达

如图4所示，MCT mRNA在RA患者与健康对照组PBMC中均表达。活动期RA患者的MCT mRNA表达水平与健康对照组相比增加了52倍，差异有统计学意义（χ2＝5.017，P＜0.05）。稳定期RA患者与健康对照组中MCT的表达相比差异无统计学意义。

图4 类风湿关节炎患者PBMC中MCT m RNA的相对表达水平

3 讨论

葡萄糖代谢不但能够为生理活动提供能量，同时也能通过代谢基质组成复杂的信号途径。糖酵解是葡萄糖代谢的一种方式，能够催化一分子葡萄糖产生2分子乳酸和2分子ATP。葡萄糖代谢在糖尿病、卒中、精神分裂症和药物滥用中发挥着重要的作用［2］。目前对RA的研究主要集中于免疫、遗传和细胞生物学等方面，而对葡萄糖代谢的研究目前报道较少。近年，一些研究发现葡萄糖代谢在RA的发病机制中具有重要作用。Henderson等［1］发现RA滑膜细胞中3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶活性增高，说明RA滑膜组织中糖酵解活性增高。糖酵解速率的升高导致细胞内酸环境的产生，这种酸化微环境有可能破坏了RA滑膜组织中异常细胞的分化［3］。Yang等［4］已在RA患者外周血CD4＋T细胞中观察了糖酵解的活性状态。本研究利用Ficoll分离人PBMC，从方法学上简化了Yang等需分离CD4＋T细胞的操作步骤，同时全面分析外周血单个核细胞中包含的所有T、B淋巴细胞和单核细胞的糖酵解相关基因的表达情况。

本研究结果显示，活动期RA患者糖酵解相关基因TPI、ENO、PKM及MCT表达均明显高于稳定期RA患者和健康对照人群，而稳定期患者虽然在总体上略高于健康对照，但差异无统计学意义。这些结果表明，RA患者PBMC以糖酵解为主，尤其在活动期更为明显。这个结果与在RA患者滑膜细胞中观察到的现象一致［1］。但是，Yang等［4］却发现外周血CD4＋T细胞中这4个糖酵解相关基因的表达在健康人群与RA患者之间没有显著性差异，这个不一致的结果可能与病情严重程度有关。Yang等的研究中活动期RA患者仅为80%，由此有可能导致了糖酵解相关基因变化没有统计学差异的结果。同时除CD4＋T细胞外，PBMC中还含有大量的其他类型T淋巴细胞、B淋巴细胞以及单核细胞等，他们在激活条件下，均表现为糖酵解活性的增强［5－6］。如活化的CD8＋T细胞在大量增殖前，就表现为早期糖酵解关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性升高［7］。同时活化后的B淋巴细胞也表现为可以快速地摄取葡萄糖，并转变为有氧糖酵解的代谢方式［8－9］。

在炎症状态下，大量活化的淋巴细胞通过高速率的糖酵解反应产生ATP和蛋白质合成代谢前体物质，以维持自身的生长、克隆扩增和免疫球蛋白的合成［10－11］。本研究中TPI的升高有利于催化糖酵解和糖异生中重要反应3-磷酸甘油醛生成更多的二羟丙酮磷酸，而二羟丙酮磷酸是合成三酰甘油的原料α-磷酸甘油的重要来源。2-磷酸甘油酸经过ENO和PKM作用后产生丙酮酸，同时释放2个ATP。丙酮酸又可通过转氨基作用生成丙氨酸。糖酵解的快速升高伴随着乳酸的大量生成，已发现活化的B细胞中80%的葡萄糖转化为乳酸，而MCT的升高有利于大量的乳酸转运出细胞。糖酵解的代谢方式还有利于改变活化的淋巴细胞中葡萄糖的碳流向磷酸戊糖途径，以提供NADPH和5-磷酸核糖，或者改变糖酵解的终产物丙酮酸进入截短的三羧酸循环，以产生乙酰CoA和草酰乙酸［12］。乙酰CoA作为脂肪酸和胆固醇合成的前体，可以促进膜的生物合成［13］。类风湿关节炎作为一种自身免疫细胞活化引发的慢性炎症反应，其细胞活化与增殖需要大量的ATP，因此能量代谢方式会有其特征性的变化，如能明确这种变化与疾病进程的关系，可为RA的早期诊断及临床疗效观察提供新的指标，同时也为RA的发病机制研究提供新的思路，并可为发展基于调节能量代谢的新型治疗手段提供理论支持。

总之，本研究表明，活动期RA患者PBMC糖酵解相关基因mRNA表达显著提高，说明糖酵解反应在RA的发病过程中明显增强。有关升高的糖酵解反应在RA发病中的具体机制有待进一步探讨。

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Expression of glycolysis related gene in peripheral blood mononuclear cells of patients w ith rheumatoid arthritis

XIONG Yu-yun1，WANG Bei1，TAO Zhen1，WU Ling2，YOU Hai-yan1，WANGWen-hong3，JIAO Zhi-jun1
（1.Departmentof Clinical Laboratory，2.Departmentof Rheumatism，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To explore themRNA expression and potential significance of glycolysis related gene in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of patientswith rheumatoid arthritis（RA）.M ethods：PBMC were purified by Ficoll and glycolysis related genes mRNA expression was analysed by real-time PCR.Results：Compared with healthy control，PBMC from active RA patients significantly expressed higher level of glycolysis related genes including TPI，ENO，PKM and MCT.However，there were no significant differences in these genes between inactive group and control group.Conclusion：In RA patients，glycolysis related genesmRNA expression levelwere changed.Glycolysismay play an important role in themechanism of RA.

rheumatoid arthritis；real-time PCR；glycolysis related gene；peripheral bloodmononuclear cell

R593.22

A

1671－7783（2014）04－0351－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140141

国家自然科学基金资助项目（81301657）；镇江市卫生科技重点项目（SH2011051）

熊御云（1983—），女，博士研究生；焦志军（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：jiaozhijun＠ujs.edu.cn

2014－05－26 ［编辑］何承志