佛手叶挥发油的成分分析及生物活性研究

魏玉君， 邵邻相， 麻艳芳， 成文召， 高海涛， 张璐敏

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

佛手(Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle)是芸香科(Rutaceae)柑桔属的常绿小乔木，为香橼(Citrus medica L.)的变种，主产于闽、粤、川、江、浙等省份，其中以浙江金华佛手(金佛手)最为著名，被称为“果中之鲜品，世上之奇卉”.佛手是名贵的传统中药，其花、叶、果实均可入药，具有行气止痛、舒肝和胃、化痰止咳等功效，可用于治疗胸闷气滞、胃脘疼痛、呕吐、食欲不振、痰饮咳喘和气管炎等病症[1].研究表明：佛手柑挥发油的主要成分为香豆素类化合物、柠檬烯、蒈烯等[2-6]，具有抑菌作用[7-8]，对体外培养的人乳腺癌细胞[9]、B16黑色素瘤细胞[10]及体内B16黑色素移植瘤均有抑制作用[11]；佛手挥发油还可降低哮喘小鼠外周血、支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的水平，减少肺组织嗜酸性粒细胞浸润，拮抗气道炎症而发挥平喘作用[12].佛手叶不仅是重要的光合作用器官，也是重要的营养器官和储藏器官，具有较高的经济价值和开发利用价值[13].然而，佛手叶挥发油的主要成分和含量是否与佛手柑相同，是否也具有类似的抗菌抑癌作用，目前还未见报道.本实验用水蒸气蒸馏法提取了金华佛手叶挥发油，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)法分析了其成分，并分别用比浊法和噻唑蓝(MTT)法测定了佛手叶挥发油的抗菌抑癌作用，以期为佛手叶挥发油的开发和利用提供科学依据.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

草绿色链球菌等6株细菌由浙江省金华市中心医院提供；Hep3B等6株癌细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所；新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；DMEM培养基、RPMI1640培养基和胰蛋白酶：Gibco公司；吐温-80、噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司.

QP5050A型气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；3111型CO2细胞培养箱和1500型全自动酶联免疫检测仪：美国热电公司.

1.2 挥发油的提取

参考文献[9]，采用水蒸气蒸馏法提取金华佛手叶挥发油，无水硫酸钠干燥，4 ℃冰箱保存备用.

1.3 挥发油的气相色谱-质谱分析条件

色谱柱：VF-Wax石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；初始温度60 ℃保持2 min，升温至250 ℃保持10 min，升温速度为15 ℃/min；汽化温度为230 ℃；载气He，流量为1.0 mL/min；分流比为200∶1；进样量为1.0 μL.

质谱检测器：EI电离源、电离电压70 eV，离子源温度为200 ℃，进样量为1.0 μL.

1.4 比浊法测定抑菌活性

细菌以2×103个/孔接种于96孔板中，加入100 μL挥发油溶液，使其终浓度分别为0，10，15和30 g/L，37 ℃培养24 h，酶标仪600 nm波长下测定吸光度值，参考文献[14]的方法计算抑菌率，作图得出IC50值.

1.5 MTT法检测细胞活力

佛手叶挥发油作用于细胞6，12和24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL噻唑蓝溶液，每组5个重复，37 ℃孵育4 h后弃去培养基，加入150 μL二甲基亚砜，避光振荡15 min，全自动酶联免疫检测仪570 nm波长下测定吸光度(A)值，计算各组细胞存活率.

1.6 统计方法

2 结果与讨论

2.1 佛手叶挥发油成分分析

对佛手叶挥发油进行GC-MS分析，得到的佛手叶挥发油总离子流图如图1所示.

图1 佛手叶挥发油的总离子流图

由表1可知，本实验从佛手叶挥发油中鉴定出40种成分，其中主要成分为d-柠檬烯、γ-松油烯、对-伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬醛、β-柠檬醛、d-异松油烯、β-反式-罗勒烯和2-甲基-5-(1-甲乙基)-二环[3.1.0]己-2-烯等化合物，此外还有部分酯类和酮类化合物.佛手叶挥发油中d-柠檬烯和γ-松油烯的含量最高，这与文献[3,15]中佛手柑挥发油的主要成分一致.然而，金晓玲等[16]采用水蒸气蒸馏法提取的佛手柑挥发油的主要成分是柠檬烯(48.4%)和邻-伞花烃(30.8%)；周露等[17]从佛手叶挥发油中鉴定出30种成分，主要成分为柠檬烯、香叶醛、橙花醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮和β-月桂烯等.佛手叶的有效成分含量不仅受植株自身养分积累和叶内碳水化合物积累的影响，还受光照、温度、水分和土壤等环境条件的影响[13]，产地、气候、栽培条件等因素的不同可能是佛手叶挥发油主要成分产生差异的主要原因.

表1 佛手叶挥发油GC-MS分析结果

续表1

2.2 佛手叶挥发油对细菌增殖的抑制作用

如表2所示:草绿色链球菌对佛手叶挥发油最敏感，其IC50为1.1 mg/mL;肺炎克雷伯菌次之，其IC50为2.1 mg/mL；表皮葡萄球菌对佛手叶挥发油相对不敏感，其IC50为13.7 mg/mL;而溶血性链球菌对佛手叶挥发油最不敏感，其IC50为19.3 mg/mL.表明佛手叶挥发油具有抑制细菌增殖的作用.郭卫东等[7]采用滤纸片法测定佛手挥发油的抑菌作用，发现佛手柑挥发油对酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，而佛手叶挥发油仅对酵母菌有一定的抑制作用.这可能是因为不同的细菌种别对佛手叶挥发油的敏感性不同所致.佛手叶和佛手柑挥发油中2种含量较高的成分都是d-柠檬烯和γ-松油烯[3,15]，但其他主要成分及其含量存在着差异性[17]；另外，不同的测定方法也存在着差异性.用滤纸片法测定挥发油的抑菌作用，可能因为佛手叶挥发油的挥发作用而导致其有效成分减少；但比浊法则不会出现这种情况.以上说明，佛手叶挥发油对细菌有明显的抑制作用，将其用在食品、药品、化妆品等方面具有广阔的前景.

表2 佛手叶挥发油对细菌活力的影响

2.3 佛手叶挥发油对癌细胞增殖的抑制作用

如表3所示，佛手叶挥发油对6种癌细胞具有较强的抑制作用，随着时间的增加，IC50值越小，抑制作用越强，呈良好的时效关系.其中：Hep3B肝癌细胞对佛手叶挥发油最为敏感，佛手叶挥发油作用于Hep3B肝癌细胞6，12和24 h的IC50分别为102.9，94.6和79.3 mg/mL；人脐静脉内皮细胞株HUVEC次之；PANC-28胰腺癌细胞对佛手叶挥发油相对最不敏感，挥发油作用于PANC-28细胞6，12和24 h的IC50分别为347.9，329.5和279.9 mg/mL.本课题组已报道的研究表明，佛手柑挥发油对体外培养的B16黑色素瘤细胞、MDA-MB-435人乳腺癌细胞有显著的抑制作用，低剂量的佛手柑挥发油可诱导癌细胞凋亡，而高剂量的佛手柑挥发油可直接导致癌细胞坏死[9-10]；佛手柑挥发油对体内小鼠B16黑色素移植瘤也有显著的抑制作用，这与其增强了小鼠的抗氧化能力有关[11]. 佛手叶挥发油与佛手柑挥发油均具有含量最高的d-柠檬烯和γ-松油烯[3,15]，以及多种其他相同成分[17]，佛手叶挥发油也可能通过诱导癌细胞凋亡来抑制其增殖.具体哪种成分起抗癌抑瘤作用，还有待于更深入的研究.

表3 佛手叶挥发油对癌细胞活力的影响

3 结 论

从佛手叶挥发油中鉴定出40种成分，其主要成分为d-柠檬烯、γ-松油烯、对伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯等，d-柠檬烯和γ-松油烯的含量最高，分别为50.53%和24.05%.佛手叶挥发油对草绿色链球菌等6种细菌、Hep3B等6种癌细胞均有明显的抑制作用，而发挥作用的具体成分还有待于更进一步的研究.采用水蒸气蒸馏法提取佛手叶挥发油，得率高、产量稳定、无有机溶剂残留、无污染，将其直接应用在食品、药品和化妆品等方面具有广阔的前景[18].本实验为佛手的综合利用和深加工提供了科学依据.

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