籼稻“成恢448”组培体系的建立

孙青芝, 吕冰洁, 马伯军

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

水稻品种“成恢448”是由籼型恢复系871028与美国稻种Lemont杂交育成的新恢复系，具有较强的恢复力，与珍汕97A，冈46，Ⅱ-32A，D62A，K17A和大粒A等多个不育系测交后,F1代的平均结实率为83.39%，表现出较强的产量杂种优势.该恢复系也具有较好的广亲和性，与籼稻测验种南京11和IR36杂交,F1平均结实率为85.89%；同粳稻测验种巴利拉、秋光测交,F1平均结实率为69.04%[1].“成恢448”对稻瘟病具有抗性，但是却不抗白叶枯病[1-2].本研究小组多年的大田接菌实验也表明，“成恢448”对白叶枯病多个菲律宾生理小种都显现高度感病.“成恢448”非常适合抗白叶枯病转基因育种的理论与应用研究.目前，许多学者利用农杆菌介导法、基因枪轰击法等将抗白叶枯病基因Xa21转移到栽培品种台北309[3]，IR72[4]，IR64和BG90-2[5]，以及明恢63、珍汕97B、盐恢559[6]等，但成功的前提之一就是需要建立这些栽培品种的受体系统.目前，粳稻日本晴、中花11等的组织培养体系已经非常成熟[7-8]，但籼稻的愈伤组织诱导、继代及分化都相对较难[9-11]，且不同品种的组培条件差异性也较大[12-14].所以，尽管已报道了93-11，IR24和IR6等多个籼稻品种的组培体系研究[15-16]，但是并不适用于所有的籼稻品种.本文利用生物统计学原理设计了不同激素浓度配比的诱导培养基和分化培养基，优化了籼稻“成恢448”的组织培养体系，为该强优恢复系的转基因育种奠定了坚实基础，同时也为籼稻抗白叶枯病基因的克隆与功能研究提供了一个遗传转化的受体.

1 材料与方法

1.1 水稻愈伤组织的诱导与继代

用籼稻(Oryza sativa L. ssp. indica)“成恢448”的成熟种子，去壳，挑取颗粒饱满的颖果，在超净台进行如下操作：在70%乙醇溶液中浸种2 min，无菌水清洗3次，转入30%次氯酸钠溶液180 r·min-1震荡30 min，无菌水清洗3次，再在1%过氧化氢溶液中180 r·min-1震荡3 h，最后用无菌水清洗3～5次，放在无菌滤纸上干燥30 min.消毒干燥后的种子铺在诱导培养基中.诱导培养基是以MS(Murashige & Skoog)培养基为基本培养基[17]，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麦芽糖、3 g/L植物凝胶，以及不同质量浓度的萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和激动素(KT)(各激素的质量浓度见表1)，pH=5.8，在28 ℃恒温培养(光照14 h/黑暗10 h).诱导2周后，摘下愈伤组织，继代培养，计算诱导率和每克愈伤组织增质量，筛出最佳的愈伤组织诱导培养条件.

1.2 水稻愈伤组织的分化与植株再生

在超净台中，将继代培养2周的愈伤组织置于不同的分化培养基上，分化培养基是以MS培养基为基本培养基，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麦芽糖、3 g/L植物凝胶,以及不同质量浓度的NAA、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和KT(各激素的质量浓度见表2)，pH=5.8,在28 ℃恒温培养(光照14 h/黑暗10 h).2周后计算出绿率，1月后计算出苗率.

1.3 各项指标的计算方法

愈伤组织诱导2周后，摘下愈伤组织，并称出愈伤组织的质量m1，继代2周后称出愈伤组织的质量m2，计算每克愈伤组织的增质量.

2 结果与分析

利用已报道的籼稻组织培养的技术参数[4,6-8]，诱导“成恢448”的愈伤组织，发现愈伤组织诱导率非常低，愈伤组织质量不好，且容易褐化.为了获得“成恢448”组织培养的最佳体系，笔者利用正交实验原理，设计了不同激素3因素4水平的诱导培养基参数和3因素3水平的分化培养基参数，探索了该水稻品种最优化的组培体系.

2.1 不同激素配比下“成恢448”愈伤组织的诱导率和生长速率

激素2,4-D，NAA和KT在不同程度上能促进愈伤组织的诱导.根据3因素4水平正交实验方法，设置了16种含有不同质量浓度的NAA，2,4-D和KT的MS诱导培养基(见表1，编号1～16)，将“成恢448”的种子(成熟胚)接种到培养基上，生长5 d后开始诱导出淡黄色的愈伤组织，14 d长成大块愈伤组织.经统计，16种诱导培养基上愈伤组织诱导率都在50%以上，其中8种培养基上诱导率达到70%以上，而4号培养基上诱导率最高，达到了93%.在不添加任何激素的对照培养基(见表1，编号17)上，种子只长根和芽，没有愈伤组织形成.愈伤组织增质量即愈伤组织生长速率，可以代表愈伤组织的活性[9].将诱导得到的愈伤组织摘下，转移到继代培养基上培养2周，计算每克愈伤组织增质量.如表1所示：在4号培养基上每克愈伤组织增质量最高，活性也较好；3号培养基次之；而其他培养基的每克愈伤组织增质量均较低，活性较小.

表1 不同激素配比下“成恢448”愈伤组织的诱导率和生长速率

不同配比的激素进行诱导培养，三者表现为综合作用.对于本实验中“成恢448”成熟胚愈伤组织的诱导，虽然3号培养基上的每克愈伤组织增质量最高，达到(5.09±0.27) g，但其诱导率却不高，只有65.97%;而4号培养基上的每克愈伤组织增质量仅次之，为(4.81±0.64) g，但其愈伤组织诱导率最高，达到93.54%.因此，4号培养基的激素配比(1.0 mg/L 2,4-D,4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT)最适宜“成恢448”成熟胚愈伤组织的诱导和继代.

2.2 不同激素配比下“成恢448”愈伤组织的分化情况

选取4号培养基诱导的优质愈伤组织，转移到不同激素配比的分化培养基(见表2，编号18～26)上，15 d时统计出绿率，1月后统计分化率.由表2可知：“成恢448”愈伤组织的出绿率和成苗率普遍较低，虽然每种培养基都能促进少许愈伤组织出现绿点，但绝大部分培养基上的出绿率均在10%以下，成苗率也较低，或没有成苗(如编号18，20，22，26)；而25号培养基上的出绿率和成苗率分别达到了32.4%和6.0%，高出其他培养基上的数倍，即1.0 mg/L NAA，2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L KT适宜“成恢448”愈伤组织的分化与植株再生.

“成恢448”成熟胚的组培过程如图1所示.

表2 不同激素配比下“成恢448”愈伤组织的分化

图1 “成恢448”成熟胚的组培过程

3 讨 论

植物生长调节剂在愈伤组织的诱导和分化中起着很大的作用，植物生长素/细胞分裂素的比率高通常促进愈伤组织的萌发，而比率低则促进愈伤组织的分化.植物生长素2,4-D或NAA对于愈伤组织的诱导和增殖是必需的[18-23].另外，文献[24]和[25]分别证明了2,4-D与KT配合使用更能促进胚性愈伤组织的形成，而单独使用2,4-D得到的只是无胚性的愈伤组织.本实验中，用不添加任何激素的MS培养基(见表1，编号17)诱导“成恢448”愈伤组织时，没有愈伤组织形成，只疯长根和苗，而在培养基中添加2,4-D，NAA和KT后均有数量不等的愈伤组织形成，表明在培养基中添加适量的2,4-D，NAA和KT确实有利于愈伤组织的萌发，这与文献[15]对7种籼稻愈伤组织诱导的研究结果是一致的.虽然这3种激素的混合能在不同程度上诱导愈伤组织，但激素间不同浓度的搭配更加至关重要.当2,4-D的质量浓度为1.0～2.0 mg/L时，愈伤组织的诱导效果均良好，且在1.0 mg/L时每克愈伤组织增质量最大，为5.09 g,基本与水稻93-11的5.86 g[26]齐平.而NAA的质量浓度在一定范围内则越高越好，表1中16种诱导培养基的诱导率均不错，全在50%以上，甚至最高的达到了90%以上，超过了粳稻日本晴[7,26].当KT的质量浓度为1.5～2.0 mg/L时，愈伤组织的生长速率最快，与Kommamine等[27]提出的细胞分裂素能提高原胚团的生长速率吻合.从17组培养基(见表1)中，笔者选出最佳诱导激素配比为1.0 mg/L 2,4-D，4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT.

籼稻组培体系中，愈伤组织的分化一直是一道难题.笔者通过正交实验设计的方法设计优化了“成恢448”愈伤组织的分化条件，从实验结果中可以看出，NAA，KT和6-BA对于愈伤组织的分化率不呈线性关系，这可能与各激素在分化过程中复杂的作用机制有关.愈伤组织分化过程中生长素的浓度比诱导过程中的低得多，只在0.25～1.00 mg/L之间，显然，低浓度的生长素有利于“成恢448”愈伤组织的分化，这和其他植物愈伤组织的分化[28]是相通的.与许多报道相一致的是，KT和6-BA能够在一定程度上拮抗高浓度2,4-D对愈伤组织分化的抑制作用，有利于水稻愈伤组织的分化[28-30].目前对蜀恢881，IR24和93-11等数个籼稻品种已报道了不同的再生体系[31-32],虽然针对不同品种其添加的激素浓度不同，但NAA，KT或6-BA不可或缺，可知植物生长素和细胞分裂素对于愈伤组织的再生起到不可忽视的作用.

本文建立了籼稻“成恢448”的组培体系，这一结果为该强优恢复系的转基因抗病育种奠定了坚实基础，同时也为水稻抗白叶枯病基因的克隆与功能研究提供了一个有效的转基因功能验证受体系统.

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